Композиционный материал для анионообменника и способ его получения Советский патент 1986 года по МПК C08L1/26 C08J5/20 C08K13/02 C08L3/00 C08L5/12 C08K3/36 C08K5/06 C08K5/1515 C08K5/16 C08K13/02 

СП

Изобретение относится к хншшесой технологии, а именно к композиионному материалу для анионообменниа и способу его получения, и может ыть использовано при разделении и 5 очистке белков.

Целью изобретения является придание материалу высокой активности к б.елкам.

Прим;ер I.KIOr пористой двуокиси кремния, с удельной поверхностью 50 --Сферозила ХОВ 030, пропитанного раствором диэтиламиноэтилдекстрана (ДЭАЭдекстрана) при рН 11,5, ВТ соотношении, мас.%: ДЭАЭдек- 15 стран 15 (ЗО мл 5%-ного раствора), минеральная окись - остальное,, а затем высушенного в печи с получением гомогенного порошка, прибавляют 20 МП 5%-ного раствора 1 4-бутандиол- 20 глицидилового простого эфира в диэтиловом эфире, смесь перемешивают при до полного испарения диэтилового эфира и достижения равномерной пропитки диэпоксидньм соедине- 25 нием (0,5% от массы материала).

Для получения анионообменника смесь доводят до 80 °С и выдерлсивают при этой температуре 15 ч. После конечного просеивания сорбент вводят 30 сухим в колонку, промывают,ч л 0,1 н. раствора гидрата окиси натрия, затем 1 л 1 М раствора хлористого натрия, и приводят в состояние равновесия при помощи применяемого при jj хроматографии буферного раствора.

Емкость сорбента при фиксации белков составляет 40-200 мг на 1 г сорбента в зависимости от условий проведения хроматографии. При на- 0 чальной пористости сорбента 10 80 эта емкость является постоянной.

Пример 2. Юг сферозила ХОВ 015 пропитывают при 65°С 20 мл 65%-ного раствора ДЭАЭ крахмала с рН 10 до получения следующего соотношения, мас.%: ДЭАЭкрахмал 13; минеральная окись остальное.

Смесь сушат в сушильной камере50

При в течение около 15 ч до получения постоянного веса. Полученный порошок гомогенизируют, если необходимо, просеивают для удален1: я возможных апгомератов.55

К пропитанному таким образом сферолизу добавляют 20 ип 0,4%-но:го раствора 1,4-бутандиолдиглицер1-одзфи-

ра в этиловом эфире (0,8% от массы материала). Смесь непрерывно перемепшвают при 40°С до полного испарения этилового эфира и получения равномерной пропитки, затем доводят до в течение 15 ч. После просеивания носитель в сухом виде помещают в колонку, промывают 1 л 0,1 н. раствора щелочи натрия, затем 1 л 1 М раствор NaCl и уравновешивают буферным раствором, применяемым для требуемого типа хроматографии..

Емкость фиксахщи протеинов составляет 40-200 мг на 1 г носителя в зависимости от условий хроматографии.

Пример 3. Юг сферозила ХОС 005 (пористой двуокиси кремния с удельной поверхностью 10 ) пропитывают при 100°С 20 мл ВОДНОГО раствора ДЭАЭагарозы при рН 9 в следующем соотноА енин, мас.%: ДЭАЭагароза 12; минеральная окись остальное

Смесь сушат в суовюьной камере при 80°С в течение примерно 15 ч. Полученный порошок гомогенизируют и просеивают для удаления возможных агломератов. После пропитки к носителю добавляют 20 мл раствора эпихлоргидрина или эпибромгидрина в этиловом эфире (0,6% от массы материала).Смесь непрерывно перемешивают при до полного испарения этилового эфира и получения равномерного пропитьшания этим сшивающим агентом, затем доводят до 40-120°С в течение около 15 ч Если необходимо, носитель просеивают помещают в сухом виде в колонку,промывают 1 л 0,1 н. соды, затем 1 л 1М раствора. NaCl и уравновешивают буферным раствором, применяемым для данной хроматографии.

Емкость фиксацией протеинов составляет 40-200 мл на 1 г носителя в за- висимости от условий хроматографии.

Пример 4. К Юг сферозила ХОВ 030 (пористая двуокись -кремния с удельной поверхностью 50 ) добавляют 30 M;I кетонового раствора ацетата целлюлозы с концентрацией 3% при комнатной температуре. Пропитанный носитель просушивают в потоке горячего воздуха, полученный порошок диспергируют в 1 л раствора щелочи натрия при Температуре окружающей среды в течение 15 ч, что приводит к гидролизу сложного эфира целлюлозы и к регенерации исходной целлюлозы.

Во второй стадии носитель, пропитанный таким образом целлюлозой, обрабатывают хлоргидратом хлортриэтиламина в щелочной среде с рН 10 цри . Состав материала, мас.%: ДЭАЭцеллншоза 9, двуокись кремния остальное.

После сушки в сушильной камере для получения однородного порошка добавляют 20 мл О,4%-ного раствора бутандиолдиглицеридэфира в этиловом эфире (0,8% от массы материала). Смесь непрерывно перемешивают при 40°С до полного испарения этилового эфира, затем доводят до 120°С в течение около 15ч. После просеивания носитель в сухом виде помещают в колонку, промывают 1 л 0,1 н. раствора щёлочи натрия, затем 1 л 1 М раствора NaCl и уравновешивают буферным раствором для хроматографии.

Пример 5. Отвепшвают 10 г сферрзила ХОВ 015 и пропитывают его при 55°С 20 мл раствора ДЭАЭагарозы концентрацией 1,5% с рН 9. Смесь высушивают в сушильной печи при 5055°С в течение примерно 12 ч для достижения постоянства веса.

После просеивания пропитанный материал имеет следующий состав, мас.%; ДЭАЭагароза 3, двуокись кремния остальное.

К 10 г пропитанного таким образом сферозила добавляют 20 мл раствора (концентрацией 0,5%) диэпоксидного соединения формулы

СНз CH2-j:H- (CH2)2-N-(CH2VCH

6

в этиловом эфире, что соответствует концентрации этого соединения 1% по отношению к пропитанному материалу.

Реакционную смесь перемешивают при 40°С до полного испарения этилового эфира. Затем температуру повышают примерно до в течение пример но 10 ч.

После просеивания носитель набивают в сухом виде в колонку, промывают 1 л 0,1 н. гидрата окиси натрия а затем 1 л 1 М NaCl и уравновешиваю соответствующим буферным раствором, подходящим для хроматографии.

Пример 6. Отвешивают 10 г сферозила ХОС 005 и пропитывают его

20 мл 10%-ного водного раствора ДЭАЭкрахмала, нагретого до 75С, рН 8,5. Затем смесь высушивают в сушильной печи при в течение 15ч. Полученный порошкообразньй продукт гомогенизируют и просеивают для удаления агломератов.

Пропитанный материал имеет следуюащй состав, мас.%: ДЭАЭкрахмал 20, двуокись кремния остальное. К 10 г пропитанного таким образом сферозила добавляют 20 мл раствора эпибромгидрина концентрацией 2% в этиловом эфире, рН 8,5, что соответствует концентрации эпибромгидрина 4% по отнои:ению к пропитанному сферозилу. Смесь непрерывно перемешивают при 40С до полного испарения этилового эфира. Затем в течение примерно 15 ч доводят TeNmepaTypy до .

После просеивания сухим носителем наполняют колонку, промывают 1 л 0,1 н. гидрата окиси натрия, затем 1 л 1 М NaCl и уравновешивают буферным раствором, подходящим для хроматографии.

Пример 7. Прямая очистка гамма-глобулинов из сыворотки или

плазмы людей и животных.

Схема цикла для 50 г сорбента, приготовленного в соответствии с примерами, приведенЕ1ыми выше:

Приведение колонки в состояние равновесия буферным раствором с рН между 6,3 и 8, например 6,8 (буферный раствор РОц 0,01-0,02 М или буферный раствор трис-НС1 0,05 М, или раствор хлористого натрия с концентрацией 1-3 г/л) со скоростью 200 мл/см -ч.

Введение 50 мл плазмы или сьшоротки, предварительно диализованной против буферного раствора,применяемого при хроматографировании, и профильтрованной для устранения возможности

кольматажа (средняя скорость подачи 50-100 мл/см ч). В случае сорбента, приготовление которого описано в примере 1 , количество плазмы или сыворотки-на один цикл должно быть снижено до 25 мл.

Промывание колонки буферным раствором, применяемым при хроматографировании .

Собирание выходного пика, состоящего из чистых гамма-глобулинов, чистота которых проверяется иммуноэлектрофорезом, с выходом 50-100%

в зависимости от применяемых буферных растворов. Выход более высок при рН ниже 6,8 или при более высоких ионных силах, при этом возникает опасность, что продукт будет недостаточно чистым. Такое получение гаммаглобулинов освобождает их от пирогенных веществ и антигена, ассоциирующегося с гепатитом В (AgHBs), которые могут присутствовать в сьфом исходном материале.

Элюирование других белков, удерживаемых в колонке, каким-либо буферным раствором с рН 4 или буферным раствором, применяемым при хроматографировании, с добавкой 10-60 г/л хлористого натрия, или же цитратньм буферным раствором 0,05 М с рН 4-8. Продолжительность цикла примерно 2 ч (при применении простой автоматики в.один день можно провести десяток циклов, т.е. выход при обработке близок к 10 л сыворотки или плазмы на 1 кг пористой неорганической окиси в день).

Пример 8. Удаление гемоглобина при очистке альбумина из плацентарной крови и концентрирование других белков.

Фракционирование плацентарной крови спиртом по методу Коха, проходит через стадию осаждения массы глобулинов при рН 6j8 в среде 20-25%-ного этанола. В этих условиях альбумин, некоторые альфа-1, альфа-2 глобулины и гемоглобин, по существу, остаются в верхнем слое раствора. Их собирают . путем центрифугирования на холоде, разбавляют равным объемом дистиллированной воды (для снижения концентрации спирта), рН устанавливают на уровне между 6 и 7 и жидкость осветляют путем фильтрования через мембраны из сложных эфиров целлншозы

Схема цикла очистки на 50 г сорбента:

Приведение колонки в равновесное состояние при помощи буферного фосфатного раствора 0,01 М или трис-НС1 0,05 М с рН 6-7 (предпочтительно 6,5) при скорости подачи 200 мл/см ч

Введение при средней скорости подачи 100 мл/см2,ч 1000 мл описанного выше и подлежащего очистке раствора.

Промывание колонки буферным раст вором, применяем1)1м при хроматографии при той же скорости подачи. Очище ный гемоглобин удаляется из колонки при незначительной степени разбавления, в то время как другие белки, такие как альбумин, остаются фиксированными на колонке.

Элюирование бчлков, фиксированных на колонке, в условиях, идентичных приведенным в примере 2, причем пик содержит концентрированные белки и

JO практически лишенные гемоглобина. Продолжительность цикла 4 ч.

Пример 9. Концентрирование раствора протеинов, разбавленных в спиртовой среде, и удаление спирта.

5Фракционирование протеинов согласно методу Коха неизбежно приводит к повторному растворению спиртовых осадков во время осуществления различных стадий. Для этого предпочти0 тельно сильно разбавить осадок, чтобы снизить остаточную концентрацию образующегося спирта. После этого необходимо, с одной стороны, удалить спирт, с другой стороны, концентри5 ровать присутствующие белки. Это, как правило, осус ествляется путем концентрирования в вакууме, лиофилизации или диализа, но два последних способа либо весьма сложны, либо 0 являются источником депирогенов. Поэтому предпочтительно использовать следующий простой, быстрый и экономичный способ.

Примером служит раствор альбумина с концентрацией 2%, содержащий 10% спирта.

Схема хщкла очистки и концентрирования на 1 кг сорбента:

Приведение в состояние равновесия при помощи 0,01 М фосфатного буферного раствора с рН 7, скорость подачи 200 мл/см, ч.

Введение спиртового раствора альбумина с рН 7 путем прибавления соляной кислоты или гидрата окисИ натрия в зависимости от начальной величины рН, средняя скорость подачи 100 мл/см ч. Таким образом, на этой колонке можно фиксировать 200 альбумина (либо 10 л раствора за цикл); если альбумин плохо фиксируется на колонке, следует лишь достаточно разбавить исходный раствор дистиллированной водой, чтобы снизить ионную силу среды.

ПромываЕше дистиллированной водой, скорость подачи 200 мл/см ч и определение момента, когда альбумин не вьщеляется и заканчивается удаление спирта. Элюирование альбумина одним из следующих буферных растворов: О, 1 М раствор хлористого натрия или 0,05 раствор цитрата с рН 6,8 при этом, как правило, конечная концентрация альбумина составляет -примерно 10-12 удаление спирта является полным, вы ход при таком методе равен примерно 100%. Этот способ применим для всех белков, изоэлектрическая точка которых ниже 6,5. Если изоэлектрическа точка белков превышает эту величину метод применим при условии, что рН буферного раствора, используемого при хроматографировании, будет повышена . Все примеси, присутствующие в этих белковых растворах, также могут быть удалены при условии, что они являются электрически нейтральными (глюциды и полисахариды) или имеют положительный заряд того же типа, что и сорбент (катионы). Если приме- си имеют отрицательньш заряд, может произойти на сорбенте конкуренция с отрицательно заряженными белка да, которые желательно фиксировать. В этом случае, если степень сродства примеси к сорбенту меньше, чем степень сродства белка, и если раствор может быть разбавлен в достаточной мере водой для достижения ионной силы, совместимой с фиксацией белков на сорбенте, можно произвести удаление даже анионов. Приведенньй ниже пример иллюстрирует такое разделение Пример 10. Концентрировани и очистка альбумина в растворе каприлата натрия. Б методах фракционирования пользуют каприлат натрия для коагуляции всех белков, за исключением альбуми на, который в присутствии каприлата остается в растворе. Примером служит раствор, coдepжaш й 15 г/л альбумина и 3 г/л каприлата. Схема цикла для 1 кг сорбента, приготовленного в соответствии с- при мерами 2 и 3 (при использовании сорбента, приготовление которого описано в примере 1, следует удвоить количество сорбента) : Приведение в равновесное состояни с фосфатным буферным раствором 0,01 рН 6, скорость подачи 200 мл/см.ч. Введение раствора альбумина и каприлата с рН 6 (в случае чрезмерно высокой ионной силы разбавление водой) ; средняя скорость подачи 100 мл/см Ч. В колонку можно ввести примерно 8 л раствора. Промывание колонки буферным раствором, используемым при хроматографировании, до тех пор, пока не прекратится выход каких-либо веществ из колонки. Элюирование альбумина в соответствии с методом, изложенным в предшествующих примерах. При этом получают раствор, содержащий 10-20% альбумина, которьй после доведения его концентрации до 20% содержит меньше 2,5 г/л каприлата натрия. Общая продолжительность цикла составляет примерно 4 ч. Из этого примера видно, что метод может быть распространен на очистку и концентрирование различных биологических молекул, имеющих отрицательные заряды при определенных величинах рН (нуклеиновые кислоты, белки, анионные поверхности, анионные гликолипиды). Возможность широкого применения метода и то, что колонка такого типа вьдерживает без каких-либо последствий прохождение жидкостей самой различной полярности, показано в следующем примере. Пример 11. Концентрирование и очистка ганглиозидов из водных экстрактов мозга животных. Ганглиозиды представляют собой гликолипиды, играющие важную роль в физиологии и патологии на уровне клеточных перегородок в качестве рецепторов и эффекторов. Они содержат большее или меньшее количество сиалиновой кислоты и поэтому при рН 3 заряжены отрицательно. Из 1 кг бычьего мозга можно получить около 7 л водного экстракта. Водные экстракты пропускают непосредственно через колонку из 50 г сорбента, изготовленного по примеру 3, предварительно приведенного в равновесное состояние при помощи буферного раствора трис-НСf 0,05 М, рН 6,8. Скорость подачи 200 мп/см ч. Все ганглиоз1-щы в этих условиях фиксируются на колонке. Производится предварительное промывание следующими материалами в указанной последовательности: трис-HCf 0,05 М, рН6,8, 0,1 н. раствор гидрата окиси натрия, вода; хлороформ-метанол-вода в рбъемных соотношениях 30:60:25, что позволяет удалить многочисленные примеси . После этого производится элюирование ганглиозидов-в концентрированной и очищенной форме при той же скорости подачи при помощи смеси хлороформ-метанол - 0,1 н. соляная кислота в объемных соотношениях 30:60:25. После проведения элюировакош собранньй пик нейтрализуют путем прибав ления О,1 н. раствора гидрата окиси натрия, выпаривают и растворяют в какой-либо хроматографической системе для анализа. Выход 100%. Колонка может переходить от органического растворителя к водному раствору и на оборот. Это может быть использовано для того, чтобы исключить необходимость в очистке колонки, или для того, чтобы поддерживать в колонке сте рильные условия. Формула изобретения 1. Композиционньй материал для анионообменника на основе пористого минерального носителя и полимерного связующего, отличающийся тек, что, с целью придания материалу высокой активности к белкам, он содержит в качестве минерального носителя пористую двуокись кремния с удепьной поверхностью 10-50 , а в качестве полимерного связующего Диэтиламиноэтиловое производное крах мала, Декстрана, агарозы или цбшлюло зы при следующем соотношении компонентов, мас.%: Диэтиламиноэтиловое производное крахмала, декстрана, агарозы или целлюлозы3-20 Пористая двуокись кремнияОстальное и дополнительно 0,5-4 мас.% материаа 1,4-бутандиолглицндилового простого эфира, эпихлор(бром)гидрина или иэпоксисоединения формулы Шз сНг-СН-(СН2)(СН2 -СН-рНг /х 2. Способ получения композиционного материала для анионообменника обработкой минерального носителя полимерным связующим, отличающийся тем, что, с целью придания материалу высокой активности к белкам, в качестве минерального носителя используют двуокись кремния с удельной поверхностью10-50 , в качестве связующего - диэтиламиноэтилпроизводное декстрана, крахмала, агарозы или целлюлозы, а обработку проводят пропиткой 1,5-10%-ным раствором связующего при рН 8,5-11,5 с последующей сушкой до постоянной массы при 50-120с и дополнительной обработкой 1,4-бутандиолглицидиловым простым эфиром, эпихлор(бром) гидрином или диэпоксисоединением формулы CH2-CH(CH2l7-N-(CH VCH--pH2 в количестве 0,5-4 мас.% материала.

Изобретение относится к области химической технологии, конкретно к композиционному материалу для анионообменника и способу его получения. Изобретение позволяет придать анионообменнику высокую активность к белкам за счет того, что композиционный материал для анионообменника содержит в качестве носителя пористую двуокись кремния с поверхностью 1050 , пропитанную полимерным связующим, выбранным из группы: диэтиламиноэтилпроизводное крахмала, декстрана, агарозы или целлюлозы, при следующем соотношении компонентов, мас.%: полимерное связующее 3-20J носитель остальное и дополнительно 0,5-4 мас.% материала 1,4-бутандиолглицидилового простого эфира, эпихлорбромгидрина или диэпоксисоединения формулы СНз сн2-и:н- (CH2)(CH2V (Г 6 Получают композиционный материал пропиткой минерального носителя 1,5 10%-ным раствором полимерного связующего при рН 8,5-11,5 с последующей СО сушкой до постоянного веса при 50 120 С и обработкой 1,4-бутандиолглицидиловым простым эфиром, эпихлрр (бром)гидрином или диэтоксисоединением формулы Шз ю О5 (CH2h-N-№2VCH ;pH2 00 в количестве 0,5-4 мас.% материала. СЛ