Способ получения иммобилизованной формиатдегидрогеназы Советский патент 1989 года по МПК C12N11/00 

1

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения иммобилизованной формиатдегидрогена- зы, в частности формиатгидрогеназы метилотрофных микроорганизмов, которая может быть использована как составная часть системы регенерации кофактора в различных областях биотехнологии - тонком органическом синтезе, анализе, медицинской диагностике.

Цель изобретения - повышение выхода иммобилизованной формиатдегидроге- наэы по ферментативной активности.

Способ заключается в том, что при инкубации фермента с нерастворимым аминированным носителем5 активированным глутаровым альдегидом, в инкубационную смесь дополнительно вводят кофактор фермента и конкурентные по отношению к формиату ингибиторы фермента. Соотношение фермент - никоти- намидадениндинуклеотид окисленннып устанавливают 1:2-215, а ингибитор добавляют в концентрации, равной 21,3-1430 константам ингибирования. Выход целевого продукта по активности возрастает при этом от 27 +51 до 55 - 77%.

ел

31

Способ иллюстрируется следующими примерами осуществления.

Пример 1. 250 мг аминирован- ного силохрома С-800/70 инкубируют в 2 мл дистиллированной воды при 90°С в течение 30 мин. Далее сило- хром промывают 50 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера, рН 7,0 и инкубируют при постоянном перемешивании с 10 мл 2,5%-ного раствора глутарового диаль дегида в том же буфере. Обработан- . ный альдегидом силохром отмывают от несвязавшегося глутарового альдегида на стеклянном (Ьильтре 500 мл 0, 1 М фосфатного буфера, рН 7,8 и 50 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0. К отмытому силохрому добавляют 3 мл раствора формиатдегидрогеназы (0,5 мг/мл, 6,2 . ) в С,1 М фосфатном буфере, рН 7,0, 0, + мл НАД (10 мМ) и 100 мкл раствора азида натрия (6,5 , К; ,- 10 ) (моляное соотношение фермент - НАД -азид составляет 1:215) и инкубируют при постоянном перемешивании в течение 3 ч при 25°С. Несвязавгаийся фермент смывают 40 мл раствора 3 М формиата в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,8. В результате иммобилизации к силох-ро му присоединяется 80% белка, .которые сохраняют 60% активности.

П р и м е р 2. Иммобилизацию формиатдегидрогеназы проводят согласно примеру 1. Полученный катализатор обрабатывают при охлаждении х(4 С) 3 мл раствора боргидрида натрия (10 мг/мл) в 0,2 М фосфатном буфере, рН 7,8. Удельная активность иммобилизованной формиатдегидрогеназы после обработки боргидридом не изменяется. Обработка боргидридом приводит к повышению стабильности иммобилизованных ферментных препаратов при пониженных ( 67,0) значениях рН. При хранении иммобилизованной формиатде- гидрогеназы, полученной согласно примеру 1, в буферном растворе с рН 7,0 в течение 4 мес, при 4°С наблюдается десорбция до 30% белка. Для препаратов иммобилизованного фермен- та, обработанных боргидридом натрия, в тех же условиях весь белок остается связанным с сорбентом.

П р и м е р 3. Осуществляют по примеру 1, но вместо азида натрия берут 20 мкл раствора нитрита натрия (0,1 М; 1- , 4,5 1С-4М). В результате при иммобилизации концентрация ингибитора составляет 12,3 К, а к

0

5

0

95

5

5 0 5 0

5-

144

силохрому присоединяется 83% белка, .который сохраняет 55% активности.

П р и м е р 4. Способ осуществляют по примеру 1, но НАД добавляют в концентрации 1,1 -1С-4М, а 100 мкл азида натрия берут из раствора в концентрации 5 (соотношение фермент-НАД составляет 1:20, концентрация ингибитора 1430 х К ;). В результате иммобилизации к силохрому присоединяется 80% белка, которые сохраняют 56% активности.

П р и м е р 5. Отличающийся от примера 1 тем, что в качестве сорбента используют аминогексилсефарозу, 2 г носителя инкубируют в течение 4 ч в 50 мл 2,5%-ного водного раствора глутарового альдегида при 20°С. Далее носитель отмывают на фильтре О,5 л 3 М КС1, 0,5 л дистиллирован-, ной воды и 0,5 л 0,2 М К-фосфатного буфера, рН 7,0. Затем модифицированный носитель инкубируют с раствором формиатдегидрогенаэы (4 мл. 1 мг/мл) в 0,2 М К-фосфатном. буфере, рН 7,0 при встряхивании на качалке в течение 3 ч при 25°С. Иммобилизацию проводят в присутствии НАД (2 мМ) и.азида натрия (10 М). Молярное соотношение фермент -НАД равно 1:164, а концентрация ингибитора 1000 К;.

По окончании процесса иммобилизации носитель отмывают на фильтре 100 мл 3 М НС1, 100 мл 3 М формиата натрия, 0,5 л 0,2 М К-фосфатного буфера, рН 7,0. В результате при иммобилизации сохраняется 77% ферментативной активности.

П р . И м е р 6. Способ осуществляют по примеру 3, но концентрация нитрита в реакционной смеси составляет 0,2 М (444 К). К силохрому присоединяется 86% белка, который сохраняет 60% активности.

Пример. Способ осуществляют по примеру 6, но иммобилизацию проводят в присутствии 1,5 М хлорида натрия. К носителю присоединяется 87% белка, который сохраняет 58% активности.

Пример8. Способ осуществляют по примеру 1, но вместо азида используют роданид в концентрации 6 Ю-5М (К; 1,1 - 1СЧМ, .концентрация 55 К-). К носителю присоединяется 90% фермента, который сохраняет 57% активности.

51

II р и м е р 9. Способ осуществляют по примеру 1, но вместо азида используют цианат натрия (К; 2 х ) в концентрации 2 (100 К;). К силохрому присоединяется 85% фермента, который сохраняет 60% активности.

Пример 10. Способ осуществляют по примеру 1, но концентрация формиатдегидрогенаэы в растворе составляет 5 мг/л (6,2 М), НАД 1,2 - 10 М, азид 5 (соотношение фермент -НАД 1:2).Концентрация ингибитора равна 500 К.. К силохрому присоединяется 77% фермета, который сохраняет 58% активности

Пример 11. Способ осуществляют по примеру 1, но концентра- ция формиатдегидрогеназы в растворе составляет 5 мг/мл, концентрация НАД 10 3М, азида 1,4 (соотношение концентраций фермент -НАД 1:16, концентрация ингибитора 1400 К;). К силохрому присоединяется 80% фермента, который сохраняет 56% активности.

Преимущество предлагаемого способа иммобилизации формиатдегидрогеназ заключается в том, что благодаря присутствию в реакционной смеси специфических защитных агентов процесс иммобилизации протекает с минимальными потерями активности, что позво

0

5

0

5

0

ляет получать биоорганические катализаторы на основе формиатдегидрогеназы, обладающие высокой активностью, и приводит к уменьшению расхода фермента. Восстановление лабильной азометиновой связи боргидридом препятствует десорбции фермента с носителя в процессе эксплуатации и повышает его операционную стабильность.

Формула изобрете ния

Способ получения иммобилизованной формиатдегидрогеназы, включающий инкубирование фермента в буферном растворе с нерастворимым аминирован- ным носителем, предварительно активированным глутаровым альдегидом, и отмывание носителя от несвязавшегося фермента, о тличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта по ферментативной активности, инкубирование фермента проводят в присутствии окисленного никотинамидадениндинуклеотида и конкурентных в отношении формиата ингибиторов фермента, устанавливая при этом молярное соотношение фермент- никотинамидадениидинуклеотид окисленный, равным 1:2-215 и концентрацию ингибитора, равной 12,3 - 1430 константам ингибирования.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам иммобилизации формиатдегидрогеназы.Цель изобретения - повышение выхода иммобилизованной формиатдегидрогеназы по активности. Способ заключается в иммобилизации фермента на носителе, предварительно обработанном глутаровым альдегидом. Иммобилизацию, проводят в присутствии окисленного никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и конкурентных по формиату ингибиторов фермента. Молярное соотношение фермента и НАД 1:(2-215)

концентрация ингибитора равна 12,3-1430 константам ингибирования. Для увеличения стабильности иммобилизованную формиатдегидрогеназу обрабатывают боргидридом натрия. Выход фермента возрастает с 27 до 56-77%.