Способ иммобилизации амилоризина Г 10х Советский патент 1982 года по МПК C12N11/02 

(54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ АМИЛОРИЗИНА ГЮх

I

Изобретение относится к получению иммобилизованных ферментных препаратов и может найти применение в пищевой промышленности.

Ферментньш препараты, используемые в пищевой промышленности, и, в том числе, амилорезин ГЮх, обладают низкой стабильностью, особенно после дополни- , тельной очистки. В связи с этим необходимо проводить иммобилизацию фермент-, ных препаратов с целью их стабилизации. Одним из широко используемых в пшц&вой промышленности ферментных препаратов является амилоризин ГЮх (обработка соков, виноматериалов, пива, обработка водномучнистых смесей и теста, обработка рыбы, приготовление кваса, получение цукатов и др.).

Известен способ иммобилизадии амилоризина на силикагеле. Иммобилизация фермента по этому способу происходит за счет адсорбции амилоризина в порах неорганического носителя. При этом весовое соотношение ферментного препарате

И носителя должно составлять 1:(200 400) til .

Недостатком данного способа является большой расход носителя (силикагепя), в результате чего удельная актиЕшость в расчете на целевой стабилизированный препарат снижается, хотя при адсорбции амилоризина и наблюдается активадия ферментного препарата. Другим недостатком способа является то, что связь меж10ду препаратом и носителем является адсорбционной, в результате чего может происходить адсорбция ферментного пре парата с силикагеля в последующая инактивация амилоризина.

ts

Известен также способ иммобилизации амилоризина ГЮх на полимерных носителях, в котором в качестве полимерного носителя используют, нерастворимый сополимер N -винилпирролидона с глицеди20ловым эфиром метакриповой кислоты. Иммобилизацию проводят при соотношении ферментного н носителя 1:3 по весу при 7-10®С к рН 2,5-3,5 в 0.1 М универсальном буфере. Иммобилизация достигается за счет образования ковалентных связей между аминогруппами ферментного препарата и эпоксигруппами полимера 2 . Недостатком известных способов иммобилизации амилориаина является нерастворимость целевых продуктов, что Эначительно снижает их каталитическую активность отношении нерастворимых субстратов и, следовательно, сужает об ласть применения иммобилизованного амш1ор.изина в пищевой промышленности Недостатком известных способов $шляет ся также и то, что стабилизирующее действие иммобилизации проявляется в небольшом диапазоне температуры и рН среды. Целью изобретения является увеличе ние каталитической активности ферментного препарата, а также его стабильнос ти в более широком диапазоне температуры и РН среды. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу иммобилизации амилоризина ГЮх на полимерных носителях на основе К -винилпирролидона, в качестве полимера используют во дораст воримый сополимер М виниллирролидона и акриламида, модифицированный госсипопом, при этом иммобилизацию проводят нри соотношении фермента и полимера от 1:10 до 1:4 по весу в 0,050,1 М буфере при рН 8,0-9,5 и 4-16% в течение 16-24 ч, а затем осаждают целевой продукт трехкратным объемом холодного ацетона. Иммобилизация происходит за счет того, что реакционноспособные альдегид ные группы сополимера взаимодействуют в щелочной среде с аминогруппами ферментного препарата с образованием устойчивой ковалентной связи. В резуль тате такого связь вания повышается устойчивость фермента к высокой темпера туре, а также расширяется диапазон рН стабильности фермента к щелочным и кислым средам. Каталитическая активность иммобилизованного предлагаемым способом амилоризина в отношении нерастворимых субстратов значительно вы ше, чем при иммобилизации известными сйособами за счет иммобилизации на водорастворимом полимере. . Сополимер, используемый для иммобилизации амилоризина, приготавливают следующим образом в два этапа. 14 На первом этапе проводят сополимеризаиию N -винилпирролидона с акриламидом. Для этоги смешивают 26,24 г Квинилпирролидона и 14,6 г акриламида А, и к смеси добавляют 1О,6 мл перекиси водорода (3%-ной) и 100 мл воды. Реакционную смесь нагревают 10 ч при 60-65 С. Полученный воскообразный продукт разбавляют 50-60 мл воды и осаждают 2-3-кратным количеством ацетона. Образовашиийся осадок высушивают в вакуумсушильном шкафу. Выход сополимера 85%. Характеристическая вязкость сополимера ГпЗ 0,78. Содержание мономеров в полученном сополимере составляет, мол.%: N -винилпирролидона 43, а акриламида 57, На втором этапе к водорастворимому сополимеру М -винилпирролидона с акриламидом добавляют госсипол для модификации аминогрупп сополимера. К 40 мл раствора сополимера (25 мг/мл) добавл$пот 16 мл (1 мг/мл) госсипола и выдерживают при 30-40 С ;в течение 3-4 ч. Полученный продукт (сополимер N -ви- , нилпирролидона и госсиакриламида) осаждают добавлением избытка ацетона (двухкратный объем), промешают и сушат. Соотношение мономеров N -винилпирролидона и акриламида, а также сополимера и амилоризина можно варьировать ES широких пределах. Изменяя число функциональных групп сополимера, можно получить целевые продукты с различными удельными активностями и стабильностью. Изменяя соотношение стабилизирующей полимерной добавки и ферментного препарата можно получить препараты с разной стабильностью. П,ример1.В раствор 1 г ферментнохо препарата амилоризина ГЮх с удельной активностью 200О ед/г в 50 мл 0,1 М универсального буфера (, HjPO, CHjCOOH, ; А/аОН) при рН 8,8 вводят 1 г сополимера. Смесь тщательно перемешивают и оставляют f при 4 С в течение 16 ч. После инкубации в течение указанного времени образовавщийся продукт осаждают тремя объемами холодного ацетона. Осадок отделяют декантацией, промывакуг вновь ацетоном и определяют в нем количество связанного ферментного препарата. Удельная активность иммобилизованного ферментного препарата составляет 82О ед/г в расчете на сухой продукт или 1810 ед/г в расчете на связавшийся амилоризин. П р И м е р 2 . Все операции прово дят как в примере 1, но в 50 мп буфера рН 8,8 растворяют 20О мг амипоризина ГЮх. Удельная активность иммобилизованного амипоризина составляет 231 ед/г в расчете на вес сухого продукта. ПримерЗ.К1г сополимера добавляют 1 г амилоризина ГЮх, предварительно растворенного в 50 мл 0,05 М буферного раствора рН 8,0. Смесь перемешивают и оставляют при в течение 24 ч. Остальные процесой проводят аналогично примеру 1. Удельная активность иммобилизованного амилоризина составляет 610 ед/г в расчете на вес сухого продукта. Пример4. К навеске сополимера 500 мг добавляют 50 мл раствор содержащего амилоризин гЮх (500 мг), рН 9,5. Смесь оставляют при в течение 16 ч. Остальные операции проводят как в примере 1. Удельная активность иммобилизованного амипоркзина составляет 540 ед/г в расчете на вес сухого продукта. Соотношение полимерной добавки и фе ментного препарата можно варьировать в широких пределах, однако оптимальным является весовое соотношение 1:1 при . Как видно из табл. 1-3, предлагаемы способ позволяет получить стабильный ферментный препарат, способный функцио нировать при ЗО-70®С в широком диапа зоне рН 3,0-7,0.

Зависимость каталитической активности иммобилизованного амилоризина ГЮх от рНсреды Способ 3,0 3,5 Известный 0,5 1,2 Предлагаемый 275 365

активность амилоризина в расчете на г сухого препарата. Каталитическая активность при рН 4,0 4,5 5,О 5,5 6,О 6,5 1,0 7,5 1,65 1,82 Ii9 2,0 1,6 1,45 1,2 4ОО 42О 423 42О 41О 325 23О 165 В таблицах приведены характеристики иммобилизованных известным и предлагаемым способом препаратов амилоризи- на, а также неиммобилизованного ферментного препарата. Полученньгй целевой продукт имеет более высокую каталитическую активность - 820 ед/г. Цри нагревании полученный иммобилизованный амилоризин дольше сохраняет свои катгшитические свойства (табл. 2), Полученный иммобилизованный амилоризин может быть использован в ряде производств, в частности при осветлении вшюматериалов (табл. 5). Осветление достигается уже через 96 ч, в то ер€мя как в случае применения исходного амилоризина аналогичные показатели можно получить лишь через 15-2О сут. При внедрении предлагаемого способа в производство для получения нммобшш- зованного амилоризина jae требуется дорогостоящего носителя, бифункциональных агентов. Сополимеры получаются простым, дешевым приемом, сшивающий агент легко доступен. Таким образом, при использовании предлагаемого изобретения каталитическая активность иммобилизованного на растворимом полимерном жюктеле амилоризина увеличивается. Стабильность полученного фермента выше. Время попуинактивации при увеличивается в 1О раз. Температурный диапазон применения ферментного прет1арата расширяется. Ферментный препарат можно применять в i6onee широком диапазоне рН среды. Таблица .

Изменение активности амилоризина ГЮх в растворе при 50°С и рН 4,7 Соотношение полимерной добавки и ферментного препарата (по весу) 10:1 5:1 1,7-1 Удельная актив180 231 263 HocTbi ед/г

&22141

8 Таблица2 1,2:1 1:1 1,2:1 1:4 408 458 433 ЗЗО

Применение иммобилизованного амилоризина для получения осветленных виноматериалов Примеч. ание. Указано суммарное время,

Фо рмула изобретения

Способ иммобилизации амилоризина Г10х на полимерных носителях на основе К -виниллирролидона, отличающийся тем, что, с целью увеличения каталитической активности ферментного препарата, а также его стабильности в более широком диапазоне температуры и рН среды, в качестве полимерного носителя используют водорастворимый сополимер N -винилпирролидона и акриламида, модифицированный госсиполом, при этом иммобилизацию проводят при соотношении фермента и полимера от 1:10 до 4:1 по .весу в 0,О5 - ОД М буфере при рН

Таблицаб

8,0-9,5 и в течение 16-24 ч, а затем осаждают целевой продукт трехкратным объемом ацетона.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1,Абдумаликов М. X. и др. Изучение активации амилоризина ГЮх сшгакагелем, - Прикладная биохимия и микробиология, 1977, т. 13, № 5, с. 692-695.

2.Ташки ев М. X. и др. Стабилизация и иммобилизация ферментов полимерами с функциональными эпоксигруппами. - ТТрикладнан биохимия и микробиология, 1978, т. 14, № 5, с. 703-7О8, (прототип). включая и щэемя от.стаивания.