Способ получения диагностической псевдотуберкулезной сыворотки Советский патент 1981 года по МПК A61K39/395 

I

Изобретение относится к микробиологии и касается получения диагностических препаратов.

Известен способ получения диагностической псевдотуберкулезной сыворотки путем выращивания псевдотуберкулезных микробов на питательной среде с последующей иммунизацией животныхпродуцентов: и отделением сыворотки крови 0.

Однако известный способ не обеспечивает, получения сыворотки с высокой специфичностью.

Целью изобретения является повышение специфичности сыворотки.

Эта цель достигается тем, что способ получения диагностической псевдотуберкулезной сыворотки осуществляют .путем выращиёания псевдотуберкулезных микробов на питательной среде с последующей иммунизацией животныхпродуцентов и отделением сыворотки крови, псевдотуберкулезный микроб выращивают при 10-12 С, выделяют специфический поверхностный, антиген и иммунизацию проводят однократно в дозе 0,1-0,15 мл с содержанием белка 100 мкг/мл физиологического раствора.

Согласно предлагаемому способу получения псевдотуберкулезных сывороток для иммунизации используют высокоспецифический поверхностный антиген, полученный из микробной клетки ;У. pseudotuberpulosiS без нарушения его природной структуры. Выделенный комплекс является сильным антигенным раздражителем способным даже при однократной иммунизации вызывать ги1Sпериммунный ответ макроорганизма. Для иммунизации кроликов выделяют поверхностную субстанцию псевдотуберкулезного микроба наиболее щадящим способом - механической дезинтегра20цией, что обеспечивает сохранение вещесТ:ва в нативной форме. Далее из поверхностной субстанции осаждают высокомолекулярную фракцию центрифугированием при 35000 q. Эту фракцию затем перерастворяют в небольшом, объеме низкомолекулярной фракции (супернатанте). Иммунизация кроликов смесью этих фракций с превалированием высокомолекулярного компонента обеспечивает острый иммунный ответ животных.

Для иммунизации кроликов используют антиген в низких концентрациях по белку (10-15 мкг) для одноразового внутривенного введения вещества. Антиген, взятый в дозе менее 10 мкг, гуморального ответа не вызывает. .Использование же антигена в дозе, превышающей 15 мкг, вызывает иммунологический паралич. Для получения специфических диагностических псевдотуберкулезных сывороток оптимальной дозой вводимого препарата является 10-15 мкг в 0,1 мл физиологического раствора.

Пример. Материалом для иммунизации кроликов служит комплекс поверхностных антигенов псевдотуберкулезного микроба. Чтобы получить его культуру микроба выращивают в течение 2-3 суток на мясо-пептонном агаре при 10-12 С, что позволяет сохранить микроорганизмы в S-форме (в стабильном состоянии). Затем культуру смывают физиологическим раствором с фосфатным буфером (рН 7 , 2-7 ,) .центрифугируют при 5500-6000 g об/мин в течение 30 мин и двукратно отмывают этим же раствором, центрифугируют культуру по 30 мин. Надосадочну жидкость удаляют. Осадок ресуспендируют до концентрации 200 в физиолгическом растворе с фосфатным буфером (рН 7,,), а поверхностный антиген отделяют на механическом дезинтеграторе в течение 15 мин, дающий 3000 колебаний в минуту. После отделения поверхностной субстанции бактерии осаждают центрифугированием при босо об/мин в течение 30 мин и удаляют. Суспернатант консервируют мертиолатом натрия (1:5000-1:10000, экспозиция 1 ч при 4°С) и вновь центрифугируют при 9000 об/мин (для удаления единичных бактерий). Осадок удаляют, а супернатант центрифугируют при 37000 q в течение 2-х часов при 4°С. Полученный осадок (высокомолекулярную фракцию поверхностного антигена) перераст.воряют в минимальном количестве (1/5 часть) суспер- нанта (низкомолекулярная фракция),

определяют количество белка по Лоури и разводят до концентрации 100 мкг белка в 1 мл физиологическим раствором.

Схема иммунизации животных. Кроликов весом 2, кг однократно иммунизируют внутривенно в краевую ушную вену в дозе 0,1 мл (10-15 мкг белка) препарата, растворенного в 0,1 мл физиологического раствора. Через 8 дней проводят пробное взятие крови и определяют титр гемагглютининов. 8 зависимости от индивидуальной чувствительности животных титры антител колеблются в пределах 1/6 00-1/51300. Для иммунизации животных используют антиген, приготовленный согласно предлагаемому способу, который разводят физиологическим раствором до концентрации 100 мкг белка, определенного методом Лоури. После установления титра антител животных обескровливают, отделяют сыворотку, лиофильно сушат и хранят в холодильнике при °С. Срок хранения (срок наблюдения) более года.

Специфичность сывороток проверили в реакции непрямой гемагглютинации с чумным антигенным диагностикумом и в реакции агглютинации с живыми культурами S. enteritidis, S. paratyphi Е, Е. coli 0-12, с вакцинным штаммом чумного микроба (EV) и диагностикумом брюшного тифа.

Сыворотки, приготовленные по известному способу, давали положительные РИГА и РА с чумным эритроцитарным антигенным диагностикумом и вакцинным штаммом чумного микроба (EV/) в разведении 1:50. Сыворотки,приготовленные предложенным способом, имеют положительные РИГА и РА с указанными диагностикумами в разведениях 1:АО и 1:20 соответственно. С остальными культурами реакции оказались отрицательными.

Полученные диагностические превдотуберкулезные сыворотки обладают до.статочной чувствительностью, высокой специфичностью, имеют высокую концентрацию антител и найдут широкое применение в баклабораториях санэпидстанций с целью диагностики псевдотуберкулеза и установления серологической принадлежности возбудителя заболевания. Сроки получения этих сывороток в 2раза короче известного ранее способа, что экономически более выгодно.

58890034

Формула изобретениявыращивают при 10-12°С, выделяют

Способ получения диагностической и иммунизацию проводят однократно псевдотуберкулезной сыворотки путем в дозе 0,1-0,15 мл с содержанием белвыращивания псевдотуберкулезных мик- s ка 100 мкг/мл физиологического растробов на питательной среде с после- вора.

дующей иммунизацией животных-проду-Источники информации,

центов и отделением сыворотки крови, принятые во внимание при экспертизе отличающийся тем, что, 1, Королюк A.M. Серологическая с целью повышения специфичности сы- (в диагностика псевдотуберкулеза. Канд. воротки, псевдотуберкулезный микроб дис. Л., 1971.

специфический поверхностный антиген