Способ определения зоны эквивалентности при титровании антител Советский патент 1983 года по МПК A61B10/00 

J 1х-ч I

00j0|0(o @®100000000

/Г/ /f2

11 f2

©0 00

Изобретение относится к иммунологии и микробиологии, в частности к определению зоны эквивалентности при титровании антител (антигенов), и может быть использовано при контроле иммунизации животных и готовых препаратов сывороток, иммуноглобулинов и моноспецифических антител.

Известен способ определения зоны эквивалентности при титровании антител путём последовательного разведения антигена с последующим добавлением одного и того же количества антител и определением зоны эквивалентности по максимальному осадку комплекса антиген-антитело 1.

Однако известный способ недостаточно точен, так как в производстве специфических сывороток в основном пользуются относительными способами титрования - бактериально агглютинацией, а титр выражают через максимальное разведение сыворотки, при которой еще есть ясно выраженный агглютинат гомологичной культуры.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения зоны эквивалентности при титровании антител путем последовательного разведения антигена с последующим добавлением одного и того же количества антител до образования комплекса антиген-антитело, надосадочную жидкость комплекса антиген-антитело каждого разведения сыворотки переносят в два параллельных ряда пробирок с последующим добавлением в каждый ряд пробирок эритроцитарных антительных и антигенных диагностикумов соответственно и по отсутствию реакции с соответствующими диагностикумами в параллельных пробирках определяют зону эквивалентности.

На чертеже представлена схема, реализующая предлагаемый способ.

Способ осуществляется следующим образом.

В ряд укороченных до 100 мм стандартных химических пробирок- (10 щт.) автоматической пипеткой на 1 мл одним наконечником разливают раствор первой фракции чумного микроба (Ф)) на 0,15 М растворе NaCl с рН 6,2-7,3 и 0,02% азида натрия с концентрацией белка в растворе 10 мкг/мл, начиная с 1,0 мл и щагом 0,1 мл, т.е. в первой пробирке будет 1 мл, что равно 10 мкг белка антигена; во второй 0,9 мл, что равно 9 мкг белка антигена и т.д., а в десятой пробирке 0,1 мл, что равно 1 мкг белка антигена. Меняют наконечник автоматической пипетки и объем растворов во всех пробирках доводят до 1 мл 0,15 М раствором NaCl с рН 7,2-7,3 и 0,02% азида натрия. Содержимое пробирок аккуратно смещивают, в каждую пробирку добавляют автоматической пипеткой (одним наконечником) 1 мл инактивированной при 56°С в течение 30 мин противочумной коммерческой лощадиной сыворотки, которая

предварительно количественно разведена в 100 раз 0,015 М раствором NaCl с 0,02% азида натрия и рН 7,2-7,3. Содержимое пробирок тщательно, осторожно смещивают, обрезы пробирок заклеивают водонепроницаемой пленкой, 2 ч выдерживают при 37 ±

±0,1°С и 48-72 ч при 4±1°С. Два раза в день содержимое пробирок осторожно перемешивают. По истечении указанного срока все пробирки осторожно центрифугируют 30 мин известным способом при 2-4°С (на пример, на крестовом роторе ЦЛР-1 при 500-600 об/мин). Обрезы пробирок осторожно расклеивают и, меняя после каждой пробирки наконечник автоматической пипетки, выносят по 0,5 мл супернатантов комплекса Аг-Ат в свою лунку агглютинаци0 онной доски, т.е. из первой пробирки в лунку второй пробирки в лунку А-2 и т.д. В эти же лунки добавляют по 0,5 мл нормальной кроличьей инактивированной сыворотки (ИКС) в разведении 1:100 на 0,15 М растворе NaCl с рН 7,2-7,3. Содержимое лунок тщательно смещивают и из каждой лунки ряда А переносят 0,5 мл в лунку ряда В (менять на1 онечники после каждой лунки ряда А), т.е. из Л i в лунку Вi, из 2 в лунку BZ и т.д. Лунки А„ , /4,2 и В , В,2 обычного контроля диагностикумов.

Таким образом, получено два одинаковых ряда - Л в, В ряд А закапывают по 1 капле 2,5%-ной суспензии эритроцитов, сенсибилизированных первой фракцией

- чумного микроба (т.е. ищется избыток антител), а в ряд В по 1 капле 2,5%-ной суспензии эритроцитов, сенсибилизированных иммуноглобулином из коммерческой противочумной сыворотки (т.е. ищется избыток антигена). Доску осторожно встряхивают и

0. оставляют на столе на 2 ч при комнатной температуре. При визуальном учете сравнивают ряды А и В. Легко заметить две вертикальные лунки в этих рядах, где отрицательная реакция как с эритроцитами с Oi чумного микроба, так и с антительными эритроцитами, т.е. в пробирке с соответствующим номером лунки выдерживается условие, что в зоне эквивалентности в надосадочной жидкости нет ни антигена, ни антител.

0 Пример. Формализованные эритроциты барана сенсибилизируют первой фракцией чумного микроба ЕВ76 линии НИИЭГ и иммуноглобулином коммерческой противочумной агглютинирующей лощадиной сыворотки серии 109 производства Саратовского НИИ «Микроб по стандартной методике. Комплекс антиген-антитело получают по стандартной методике Гейдельбергера путем разведения первой фракции чумного микроба до концентрации 10, 9 и 8 мкг/мл и т.д. до 1 мкг/мл. Белок, определяют во всех случаях по методу Лоури на ФЭК56 М.. Сыврротку серии 109 используют в разведении 1:100 (инактивированную прогреванием при 56°С в течение 30 мин). Смесь по 1 мл антигена указанных концентраций. и по 1 мл сыворотки серии 109 в разведении 1:100 прогревают 2 ч при 37°С и выдерживают 72 ч при 3°С с периодическим перемешиванием. Определение зоны эквивалентности реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) производят согласно описанию в разделе осуществления способа на стандартной агглютинационной доске с супернатантами комплекса антиген-антитело и антигенными, антительными эритроцитарнымидиагностикумами. Учет результатов производят через 2 ч. Только в лунках А-2 с эритроцитами, сенсибилизированными первой фракцией, и В-2 с эритроцитами, сенсибилизированными иммуноглобулином, реакция отрицательная одновре.менно, т.е. в этом участке кахо.оягсм зона эквивалентности, где в надосадочнон жидкости нет ни антител, ни антигена. Таким образом, общее количество белка в сыворотке серии 109 содержится 100 мг/мл (10 гр.%), количест во антител к первой фракции чумного микроба 15 мг/мл, OTHouiefiHc ап.тн-гсн-аптитело в зоне эквивалент ;, ч и ггрнблизительно 1:17, титр сыворотки к первой фракции чумного микроба 900 мкг/мл. Время для обнаружения зоны эквивалентности согласно предлагаемому способу от начала иостановк РПГА до ее учета равно 2 ч 17 мин. Таким образом, предложенный способ позволяет с большей точностью (в 2--К) раз) осуществлять определение зоны эквивалентности, что имеет большое теоретическое н практическое значение при определении аффинитета антител, как мере их авидности, валентности антител, нри опреде чении динамики образования неполных антител при иммунизации животных и человека, нри анализе препаратов моноспецифических антител, полученных методом аффинной хроматографии.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗОНЫ ЭКВИВАЛЕНТНОСТИ ПРИ ТИТРОВАНИИ АНТИТЕЛ путем последовательного разведения антигена с последующим добавлением одного и того же колнчества антител до образования комплекса антиген-антитело, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, надосадочную жидкость комплекса антиген-антитело каждого разведения сыворотки переносят в два параллельных ряда пробирок с последующим добавлением в каждый ряд пробирок эритроцитарных антительных и антигенных диагностикумов соответственно и по отсутствию реакции с соответствующими диагностикумами в параллельных пробирках определяют зону эквивалентности.