Способ анализа в жидкостной хроматографии Советский патент 1981 года по МПК G01N31/08 

(5) СПОСОБ АНАЛИЗА В ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

I

Изобретение относится к жидкостной хроматографии и может быть использовано при детектировании оптическими методами.

Известен способ детектирования в плоскостной хроматографии, включающий облучение пластинки, состоящей из слоя сорбента на подложке, пучком света определенной частицы и регистрации прошедшего или отраженного света l .

Недостатком известного способа является относительно низкая чувствительность и значительное рассеяние светового потока на слое сорбента.

Известен также способ анализа в жидкостной плоскостной хроматографии, включающий разделение веществ на тонком, слое сорбента, высушивание пластинки и спрыскивание полученной сорбционной системы реактивами, селективно вступающими во взаимодействие с разделенными веществами с образованием окрашенных производных, з результате чего увеличивается экстинкция зон на слое сорбента 2.Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является метод гашения флуоресценции, основанный на предва рительном разделении смеси веществ, высушивании пластинок и введении в слой сорбента индикатора, который в результате взаимодействия с разделенными веществами теряет способность флуоресцировать при облучении пластинки соответствующим излучением, в то время как свободные участки сорбента флуоресцируютt3j.

Недостатки этого метода следующие. Предел детектирования при оптическом определении количества вещества в зоне зависит от соотношения пропущенного (отражённого) и поглощенного (рассеянного) излучения.В известных методах оптимизация этого соотношения направлена на увеличение поглощения излучения веществом в зоне по от3ношению к рассеянному на сорбенте из лучению. Однако не предпринимались попытки уменьшить рассеяние света сорбентом на готовой тонкослойной хроматограмме.Опрыскивание хроматограммы различными реактивами затрудняет подчас идентификацию соединений в том числе по их спектрам при работе со спектрофотометром КМ-3. Кроме того, нет универсального проявляющеjго реактива, что затрудняет проявление обычными методами хроматограмм сложных смесей. Реактивы могут вступать во взаимодействие с примесями и давать ложные зоны или снижать разность в экстинкции зон и свободных участков сорбента. В зависимости от выбранной системы растворителей.в качестве элюента зона вещества может локализироваться у наружной поверхности слоя, в его центральной части поперечного сечения и у поверхности, контактирующей с подложко В последнем случае эффективность опрыскивания проявляющим реагентом может оказаться низкой, в целом, KOI- да различные вещества локализуются по-разному в поперечном сечении слоя необходимы дополнительные процедуры калибровки, в противном случае резул таты анализа нельзя считать достовер ными и представительными. Целью изобретения является снижение повышения чувствительности и рас ширение возможностей идентификации веществ, разделенных на плоском сорбирующем слое. Поставленная цель достигается тем что согласно способу анализа в жидкостной хроматографии, включающем разделение смеси веществ на тонком сорбирующем слое, после окончания ра деления тонкий слой сорбента заполня ют жидкостью ,с коэффициентом преломления, равным или близким коэффициен ту преломления сорбента, и проводят оптическое детектирование полученной системы. Суть изобретения состоит в том, что при прозрачной подложке слой сорбента становится оптически прозра ным (или близким к этому), в результате чего уменьшается рассеяние падающего света на слое сорбента. Этот вариант применим как в случае сканирования по пропусканию, так и по отражению. Применим он и в случае дете тирования с переменной длиной волны падающего света. Жидкость, иногда на зываемую иммерсионной,наносят на слой опрыскиванием, окунанием пластинки или подводом за счет капиллярных сил, аналогично подводу элюента Детектирование можно также проводить в кассете из достаточно прозрачного стекла или полимерного материала, например,, покрывая пластинку сверху полиэтиленовой пленкой для предотвращения испарения жидкости. Возможно также введение в ее состав добавок, снижающих общую летучесть системы. Возможно продувание над пластинкой инертного газа, например, азота, насыщенного парами жидкости. Для снижения скорости испарения воз-можно охлаждение всей системы до температуры, когда испарение не вносит существенных погрешностей в измерения. Детектирование можно осуществлять путем перемещения световодов по поверхности пластинки, смазанной компаундом, имеющим тот же коэффициент преломления, что и световод, например, канадским бальзамом. В состав жидкости можно вводить незначительные добавки проявляющих реактивов, не изменяющих существенно оптические свойства системы. Аналогичный способ можно использовать и в колоночной жидкостной хроматографии. Пример 1.В ходе -исследования аминокислотного состава физиологических жидкостей из мозга и печени крыс, находившихся в момент операции в состоянии гипоксии и в нормальных физиологических условиях, соответстт вующие хроматограммы, полученные на пластинках фирмы Е.Мерк и на пластинках с незакрепленным слоем, изготовленных в лабораторных условиях, с силикагелем, обрабатывают метыреххлористым углеродом. Детектирование проводят на спектрофотометре фирмы Оптон КМ-3. Результаты исследования показывают следующее. Соотношение поглощен.ного к рассеянному свету при использовании ртутной и ксеноновой ламп, а также вольфрамовой лампы, больше в раз (в зависимости от используемого слоя сорбента), чем в известном методе; отпадает необходимость использования кингидрина для проявления ряда аминокислот; в ходе идентифилации получены стабильные характеристические спектры разделенных веществ, что повышает надежность их идентификации дефекты поверхности слоя силикагеля без связующего не сказываются на результатах определения. Пример 2. Условия эксперимента аналогичны примеру 1, но в качестве жидкости используют толуол. Система получается менее оптически прозрачной, в связи с чем указанное соотношение изменяется от 1,4 до 6. Толуол подают на пластинку как восходящим, так и нисходящим способом через листок фильтровальной бумаги. Над поверхностью пластинки продувают азот, который, барботируют через подо гретый толуол. Эксперименты показывают., что направление газо-парового потока целесообразно выбирать таким же, что и для элюента. Пример 3. Условия эксперимента аналогичны примеру 2, нО детек тирование проводят при температуре от +28°С до -7°С, что несколько снижает скорость испарения толуола и че тыреххлористого водорода и облегчает условия проведения детектирования. Пример . При определении цитруллина, мочевины, триптамина и триптофана улучшают условия детектирования путем обработки хромятограммы Ц-ным раствором {-диметиламинобензальдегида в таноле, зате выдерживают хроматограмму 3-5 мин в парах соляной кислоты, а затем обрабатывают четыреххлористым углеродом и проводят детектирование. Предел определения снижается в 2-8 раз. Реактив можно добавлять сразу в жидкость. Пример 5. Условия определения как в примере 1. К четыреххлорис тому углероду добавляют 3% четырехбромистого углерода, что снижает общую летучесть системы и п озволяет . проводить определение при сравнитель но высоких температурах, что особенн важно при изучении динамики гипоксии детенышей-хлопковых крыс. Пример 6. Условия эксперимента аналогичны примеру 1, но детек тирование проводят по отражению с использованием зеркальной подложки. Жидкость наносят опрыскиванием или окунанием. Пример 7. Условия эксперимента аналогичны примеру 1. После подведения жидкости к слою пластинку накрывают тонким листом полиэтилена или кварца и осуществляют детектирование с одновременной регенерацией пластинки фирмы Е.Мерк (они доста7точно дороги) путем непрерывного отвода жидкости аналогично тому, как это делают в БН-камере с одновременной непрерывной додачей жидкости к противоположному,концу слоя сорбента. П ри м е р 3. Высушенную хроматограмму покрывают слоем канадского бальзама, по которому перемещают полированный торец световода, сплетемного из волоконной оптики с коэффициентом преломления, равным коэффициенту преломления бальзама. По слою пропускают поток жидкости. Результаты, полученные в ходе лабораторных испытаний, показывают, что предложенный способ позволяет: снизить предел определения в 1,5-10 раз при прочих равных условиях; избежать ошибок,связанных с неоднородностью слоя сорбента; упростить метод путем исключения дополнительных операций проявления} получить возможность надежной идентификации веществ на спектрофотометре КМ-3 при снятии соответ-ствующих спектральных характеристик; ускорить проведение анализа; создать новое направление в ТСХ при подборе элюентов, когда учитывают не только элюирующую способность системы, но и ее оптические свойства, с тем, чтобы проводить разделение сразу иммерсионной жидкостью (например, разделение аминов на силикагеле в системе четыреххлористый углерод - этилацетат, когда описанный прием можно осуществлять сразу в проточном варианте) ; избежать дополнитель ных калибровок при различном распределении разделяемых веществ по поперечному сечению тонкого слоя сорбента. Формула изобретения 1. Способ анализа а жидкостной хроматографии, включающий разделение смеси веществ на слое сорбента и оптическое количественное и качественное детектирование, отличаюийся тем, что, с целью снижения повышения чувствительности и расширения возможностей идентификации веществ, после разделения в слой сорента вводят жидкость, сни : лющую бщую оптическую плотность сорбируюего слоя по отношению к используемоу излучению. 2. Способ ПОП.1, отличаюийся тем, что жидкость имеет оэффициент преломления равный или близкий коэффициенту прр.ломления сор ,бента. 3. Способ поп,1,отлича ю щ и и с я тем, что в жидкость вводят добавки, снижающие летучесть раствора. k. Способ по nil,отли чающий с я тем, что над пластинкой в ходе детектирования продувают поток таза, насыщенного парами жидкости. 5.Способ поппЛи, отли,4 а ю щ и и с я тем, что продувку осуществляют в направлении перемещения элюата по тонкому слою. 6.Способ поп.1,ртличающ и и с я тем, что жидкость наносят опрыскиванием или окунанием. 7.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что жидкость подводя и отводят от слоя сорбента аналогичн элюенту (элюату) при непрерывном хро матографировании. 8.Способ по п.1, отли чающий с я тем, что слой сорбента до 8 .8 полнительно обрабатывают проявляющим реагентом. 9.Способ по пп.1 и 8, о т л и чающийся тем, что проявляющий реагент вводят в состав жидкости. 10.Способ по п.1, отли чающий с я тем, что детектирование проводят при температурах в интервале от +28С до -7°С . 11. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что слой сорбента покрывают пластинкой из оптически прозрачного материала. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Шталь. Э. Хроматография в тонких слоях. М., Мир, 1965, с.57. 2.Ахрем А. и Кузнецова А. Тонкрлойная х-роматография. М., Наука, 1964, c.if5. 3.Беленький Б.Г. и Виленчик Л.З. роматография полимеров. М., Химия. 1Э78, С.27 (прототип).