Способ получения тафцина Советский патент 1981 года по МПК C07K5/103 C07K1/08 C07K5/117 A61K38/07 

Изобретение относится к получению биологически активного тетрапептида-тафцина, который стимулирует фагоцитозную активность лейкоцитов крови и может найти применение в медицине. Известны способы получения тафцина с использованием твердофазного и классического методов пептидного синтеза, также с использованием полимерных активированных эфиров . Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения тафцина, Основанный на основании полимерных активированных эфиров N-защищенных а -аминокислот 4. Согласно этому методу нерастворимый полимерный алкнлированный зфир 1, полученный из N-защищенной аминокислоты и полимера активатора, конденсируют с зфиром а -аминокислоты, содержащим свободную ааминогруппу И. Образующийся при этом защищенный дипептид III переходит в раствор, а избыток непрореагировавщего полимерного активированного эфира N-защищенной о-аминокислоты и полимер-активатор IV удаляют фильтрацией. После удаления N-концевой аминозащитной группы дш1ептвда операцию повторяют до получения желаемого пептида с заданной аминокислотной последовательностью : 1 X-NH-CHR-COO-P + HiN-CHR-COOY- Х-NH-CHR-CONH-CHR-COOy + Р-ОН IW где X - . аМинозащитная группа; У - карбоксилзащитная группа; Р - полимер-активатор. Однако используемые в известном способе полимерные активированные эфиры на основе сополимера стирола с 2% дивинилбензола являются гидрофобными полимерами, т. е. практически не набухают в водной среде и практически не реагируют с водорастворимыми амкнокомпонентами, и, в частности, со свободным L-aprHiraHOM и пептидами, содержащими свободный L-аргинин. По зтой причине синтез ведут в среде органического растворителя с использованием Ы -защищетюго эфира L-аргинина. Использование М -защищезгаого эфира L-аргинина приводит к значительному увеличению себесюимости конечного продукта, и, создает большие трудности на стадии деблокирования защищенного конечного тетрапептида. Для полного удаления N - NO2-защитной группы аргинина необходимо использовать безводный фтористый водород, который является очень токсичным соединением, и для работы с которым необходимо специальное оборудовакие 51. Кроме того, использование органических растворителей в качестве среды для синте также увеличивает себестоимость конечного про дукта. Указанные недостатки приводят к усложнени процесса и повышению себестоимости конечного продукта и делают этот метод малопригодным для крутшотонного производства тафшгаа. Цель изобретения - упрощение способа полу чения тафцина. Поставленная цель достигается способом получения тафцина последовательным наращиванием пептидной цепи в присутствии гидрофил ных поли-Ы-оксисукцинимидных эфиров общей формулы X - А - Р где X - трет.-бутоксикарбонилгруппа; /l-LPi O, i,(i}-, L-Tltcк«ч N-0- Ш-N ЛD где R - остаток N-винилпипролидона; 4,4 -диаминодифенилоксида; R - остаток стирола; и процесс ведут в водной среде в интервале рН 8-10. Предлагаемый способ позволяет проводить синтез тафцина с использованием свободного С-концевого Л-аргинина, что значительно упрощает и удешевляет весь процесс. Использован свободного Л-аргиншш позволяет исключить стадию деблокирования конечного тетрапептида безводным втористым водородом. Последнее обстоятельство имеет особенно большое значение для промышленного производства тафцина так как фтористый водород является очень то сичным соеш нением и работа с ним требует специального оборудования. Кроме того, замен органического растворителя на водную среду дает большой экономический эффект и снижает пожароопасность всего процесса. Исходные поли- N- оксисукцинимидные эфиры N-зашищенных а-аминокислот получают известным методом смешанных ангидридов из N-защищенной а-аминокислоты и поли-Ы-оксисукцинимидного гидрофильного полимера-активатора 6. В свою очередь полимер-активатор получают сишванием диамином смеси сополимера малеинового ангидрида с N-винилпирролидоном и сополимера малеинового ангидрида со стиролом с последующей обработкой гидроксиламином 7. Пример 1. N-трет.-Бутилоксикарбонил-L-пролил-L-аргинин. К раствору 2,26 г (13 ммоль) L-аргинина в 10 мл воды прибавляют при перемешивании 2,1 г (13,8 ммоль) поли-Ы-оксисукцинимидного (ПОС) эфира N-трет.-бутилоксикарбонил-L-пролина. Реакционную смесь перемешивают 48 ч при рН-9,0. Протекание процесса контролируют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах Силуфол. Затем избыток непрореагировавшего ПОС эфира N-трет.-бутилоксикарбонил-L-пролина и полимер-активатор отфильтровывают, промывают водой (2 раза по 15 мл), метанолом (15 мл). Объединенный фильтрат упаривают в вакууме. Остаток промывают этанолом (20 мл), этилацетатом (20 мл) серным эфиром (20 мл), отфильтровывают и сушат. Выхбд 4,10 г (82%), белое кристаллическое вещество. Т. пл. 178-185, 48,8° (с. I, МеОН). R - 0,78 (н-бутанол-пиридин-уксусная кислота - вода 10:5:4:4), Rr - 0,43 (н-бутанол-н-пропанол-вода- хлоруксусная кислота 65:15:20:3) (ТСХ на пластинках Силуфол , ЧССР). Найдено, %: С 49,44; Н 7,97; N 18,00 C. Вычислено,%: С 49,36; Н 7,97; N 17,99 Пример 2. N -трет-Бутилоксикарбонил- N -бензилоксикарбонил- L-лизил- L-пролил- Lаргинин. К 1,40 г (3,64 ммоль) N-трет.-бутидоксикарбонил-L-пролил-L-аргинина (см. пример I) растворяют в 5 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 25 мин при комнатной температуре и упаривают в вакууме. Остаток промывают серным эфиром (3 раза по 20 мл) и растворяют в 25 мл воды. К полученному раствору прибавляют 5,8 г (5,7 ммоль) ПОС эфира N -трет.-бутилоксикарбонил-Ы -бензилоксикарбонил-L-лизина. Реакционную смесь перемешивают 30 ч при рН 8,4, контролируя протекание реакции с помощью ТСХ. Затем полимер отфильтровывают, промывают водой (2 раза по 20 мл) и метанолом (3 раза по 20 мл). Объедикенный фильтрат упаривают в вакууме. Остаток промывают серным эфиром (3 раза по 20 мл) и суспендируют в воде, рН суспензии доводят до 3,5 и экстрагируют этилацетатом (2 раза по 20 мл). Водный слой отделяют, насыщают хлористым натрием и выпавший при этом маслянистый осадок отделяют сушат в вакууме и затирают с серным эфиром Образовавшийся твердый осадок отфильтровывают и сушат в вакууме. Выход 1,48 г (61%), белое аморфное вешес тво. Т.размягчения 110°, 43,0° (с. 1, МеОН). R - 0,50 (н-бутанол-н-пропанол -вода-хлору ксусная кислота 65:15:20:3), R 0,36 (этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода 1:1:1:1) (ТСХ). Найдено,%: С 55,20; Н 7,60; N 15,10 СзоН47М70в HjO Вытаслено,%: С 55,23; Н 7,58; N 15,04 Аминокислотный анализ: Lys 0,96; Pro 1,00 Arg 0,94. Пример 3. N-трет-Бутилоксикарбонил -L-треонил- N - бензилоксикарбонил- L-лизил- L-пролил- L- аргинин. 0,58 г (0,89 ммоль) N -трет.-бутилоксикарбонил- N - бензилоксикарбонил- L-лизил- L- пролил- L-аргинина (см. пример 2) растворяют в 5 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 30 мин и упаривают в вакууме. Остаток промывают серным эфиром (2 раза по 15 мл), растворяют в 10 мл воды. К полученному рас вору прибавляют 2,0 г (2,5 ммоль) ПОС зфира М-трет.-бутилоксикарбонил-Ьтреонина. Реакционную смесь перемешивают 8 ч при рН 8,0. Затем полимер отфильтровывают, промывают метанолом (20 мл) и ацетоном (20 мл). Оста ток растворяют в 5 мл метанола и осаждают 10 мл серного эфира. Осадок отфильтровываю нромывают серным эфиром (10 мл) и сушат в вакууме. Выход 0,56 г (84,3%), белое аморфное соединение. а J° -37,8° (с. 1, МеОН). R. 0,40 (этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода 1:1:1:1) (ТСХ). Найдено,%: С 54,Ш; Н 7,47; N 14,56 C44Hs4N80,o.H20 Вычислено,%: С 54,24; Н 7,50; N 14,89 Аминокислотный анализ: Thr 1,01; Lys 0,98; Pro 1,00; Arg 0,98 Пример 4. М-трет-Бутилоксикарбонил - L-треонил- L-лизил- L-пролил- L-йргинин. 0,372 г (0,50 ммоль) N-трет.-бутилоксика бонил- L-TpeoHmi-Mt -бензилоксикарбонил-L-лизил-L-пролил-L-аргинина (см. пример 3) раст воряют в смеси 10 мл метанола и 1 мл уксусной кислоты, добавляют 0,2 г 5%-ного палладия на угле и перемешивают в атмосфере водорода в течение 6 ч. Затем катализатор отфильтровывают, а фильтрат упаривают в вакууме. К остатку прибавляют смесь 2 мл ерного эфира и 2 мл этилацетата, тщательно перемешивают, осадок отфильтровывают, промывают серным эфиром (5 мл) и cjouaT в вакууме. Выход 0,29 г (94%), белое аморфное соединение, ( 59,0° (с.1, МеОН).| Rj 0,92 (изопропанол-пиридин-уксусная кислота-вода 10:5:4:4); OJ2 (н-бутанол-уксусная кислота-пиридин-вода 30:6:20:24); R 0,68 (изопропанол-пиридин-вода 4:1:1) (ТСХ). Найдено,%: С 50,61; Н 8,14; N 18,12 С2бН48М,Об Вычислено,%: С 50,47; Н 8,14; N 18,12. Аминокислотный анализ: Thr 0,99; Lys 1,01; Pro 1,00; Arg 1,03. П p и м e p 5. Три-трифторацетат-L-Tpeонил-L-лизил-и-пролил-L-apnfflHHa. 0,236 г (0,381 ммоль) N-трет.-бутилоксикарбонил- L-Tpeomin- L-лизил- L-IIpoлил- L-аргинина (пример 4) растворяют в 2 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 1 ч и добавляют 20 мл серного эфира. Образовав1пийся осадок отфильтровывают, промывают серным эфиром (20 мл) и сушат в вакууме. Выход 0,317 г (98%), белое аморфное соединение. 32,2° (с.1, МеОН). RJ 0,29 (изопропанол-пиридин-уксусная кислота-вода 1:5:4:4); R 0,22 (н-бутанол-уксусная кислота-тшридин-вода 30:6:20:24) (ТСХ). Найдено,%: С 38,41; Н 5,38; N 13,30 C2,H4oN806.3CF3COOH-H20 Вычислено,%: С 38,39; Н 5,37; N 13,27. Аминокислотный анализ: Thr 1,01; Lys 1,02; Pro 1,00; Arg 0,99. Как видно из приведенных примеров, предлагаемый способ позволяет получать промежуточные и конечное соединения с достаточно высоким выходом (обший выход - 41%) без дополнительной очистки, заменить дорогие и труднодоступные : производные N -NOj-L-аргинина на дешевый и доступный свободный L-аргинин, исключить из процесса получения тафцина стадию деблокирования защищенного конечного тетрапептида с помощью фтористого водорода, исключить использование на стадии конденсации органического растворителя. Формула изобретения Способ получения тафшша путем последовательного наращивания пептидной цепи с исполь,зованием полимерных активированных эфиров М-защищенных а-аминокислот с последующим опцеплением защитных групп и вьщелеиием целевого соединения, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве полимерных активированных эфиров М-защгаценньи о-аминокнслот используют гидрофильные поли-Ы-оксисукцинимидные зфиры общей формулы X - А - Р где X - трет.-бутилоксикарбонилгруппа; .L-iyf(ir, QL Ш; О ,0 где Я -остаток N-IИlнилпиppoлндoиa; 4,4 -диаминодифенилоксида; R - остаток стирола, и процесс ведут в водной среде в интервале рН . 8916 5 «e IS 20 И .8 Источники информации, пр1шятые во внимание при экспертизе 1.Najjar V.A., Nishioka К. Tuftsin. Д natural phagocytosis stimulating peptide. Nature, 1970. v. 228, p. 672. 2.Chaudhuri M.K.. Najjar V. A. Solid-phase tuftsin (Thr-Lys-Pro-Arg) synthesistdeprotection and resin cleavage with trifluoromet- hane sulfoiitc acid.- AnaLBIochem. 1979, V. 95, p. 305. 3.Патент США Г 3778426, кл. С 07 С 103/52, 1973. 4.Fridkin М„ Stabinsky V., Zakuth V,. Spirer Z. Tuftsin and some analogs. Synthesis and interaction with human polymorphonuclear leucocytes.- Biochem., Biophys. Acta, 1977, V. , № 1, p. 203-211 (прототип). 5.Дж. Стюарт, Дж. Янг. Твердофазный синтез пептидов. М., Мир, 1971. 6. Рогожин С.В., Давидович Ю. А., Самойлова Н. А., Мирсякжа Н. В., Юртанов А. И., Андреев С. М. Синтез полимерных N-оксисукцинимядных эфиров N-замещенных амшсокислот и пептидов.- Известия АН СССР . Серия химическая, 1975, fP 2, с. 428-433. 7. Авторское свидетельство СССР № 644800, кл. С 08 F 222/06, 1979.