Поли- @ -оксисукцинимидные эфиры аминокислот в качестве реагентов для пептидного синтеза Советский патент 1984 года по МПК C07C103/52 

111 Изобретение относится jc новым coeдинeния f - поли-Ы-оксисукцинимидным эфирам аминокислот формулы где R - остаток N-защищенной аминокислоты; . R - остаток сшивающего агента: бензидина, диаминодифенил оксида, диайинодифенилметана, в качестве реагентов для пептидного синтеза, которые могут найти примене ние, в синтезе биологически активных соединений - пептидов методом активированных эфиров. Использование активированных эфлр Незащищенных аминокислот 1j широко известно в пептидной химии. Наиболее перспективным и экономич ным является осуществление синтеза пептидов методом активированных эфиров в водных средах, поскольку это позволяет осуществлять синтез в соот ветствии с принципом минимальной защиты функциональных групп и, в оптимальном варианте, исполЬзовать амино компонент в свободном виде П23. Известно использование 2 нитро-4-сульфофениловых эфиров N-защищенньп аминокислот в синтезе пептидов методом активированных эфиров, процесс проводят в водной среде Сз 3. Однако использование 2-нитро-4-сульфофениловых эфиров N-защищенных аминокислот осложняет очистку синтези руемого пептида за счет наличия в системе низкомолекулярного активированного эфира и соответствующего фенола. Цель изобретения - новый реагент для синтеза пептидов, позволяющий получать целевые продукты с высоким выходом и высокой степенью чистоты. . Поставленная цель достигается поли-К-оксисукцинимидными эфирами аминокислот формулы t в качестве реагентов для пептидного синтеза. Предлагаемые поли-Н-оксисукцинимидные активированные эфиры получают методом смешанных ангидридов из N-защищенной аминокислоты и N-оксисукцинимидного полимера-активатора. Полученный полимерный активированный эфир легко отделяется от растворимых продуктов реакции. Полимерные активированные эфиры-стабильные соединения, могут храниться в отсутствие влаги длительное время (более года). Полимер-активатор получают смешиванием ароматическими диаминами с жесткой вытянутой структурой молекулы бензидином, диаминодифенилоксидом или диаминодифенилметаном (с получением сферических гранул), смеси двух сополимеров. Это сополимер малеинового ангидрида с N-винилпирролидоном и сополимер малеинового ангидрида с этиленом; далее производят обработку сшитого полимера гидроксиламином в условиях С J. Пример 1. Получение N-оксисукцинимида. К раствору сополимера малеинового ангидрида с .N-винилпирролидоном 100 г (480 ммоль) и малеинового ангидрида с этиленом - 60 г (480 ммоль) и 300 мл диметилформамида (ДМФ) прибавляют раствор 19,0 г (96 ммоль, 10 мол.%) диаминодифенилоксида в 80мл ДМФ; полученную гомогенную систему Охлаждают до -9°С затем выливают при перемешивании в 3000 мл силикона (). Образовавшуюся эмульсин перемешивают при комнатной температуре 3 ч и оставляют на 24 ч. Затем полимер отфильтровывают., промывают эфиром, ДМФ, смесью уксусного ангидрида с ДМФ (2:1) по объему, ацетоном, эфиром, высушивают. Получают 170 г сферически гранулированного полимера. ИК-спектр (, см-): 1860, 1790. Содержание остатков малеинового ангидрида - 4,53 ммоль/г. Теоретическое содержание 4,65 ммоль/г. Суспензию полученного сшитого по:лимера в 1500 мл раствора 150 г (2158 ммоль) хлоргидрата гидроксиламина в пиродине нагревают 5 ч при 60°С. Полимер отфильтровьшают, промывают водой, 0,5 н.НС1, водой, ацетоном, эфиром, высушивают в вакууме. Выход 195 г ИК-спектр ( V, см ): 1650, 1710, 1780, 3200-3500. Найдено: N 11,21%. Вычислено: N 11,50%. Содержание реакционноспособных . N-оксигрупп в полимере-активаторе 4,22 ммоль/г. Теоретическое содержание 4,35 ммоль/г. В описанных условиях получают сферически гранулированные полиN-сукцинимиды с другими ароматически ми диаминами: бензидином, диаминодифенилметанЬм (сшитые 10 мол.%). Пример 2. Пoли-N-oкcиcyкциминидный эфир трет-бутилоксикарбонил пролина. Раствор 1,03 г (9,0 ммоль) Вос-пролина и 1,03 г (9,0 ммоль) N-этилморфолина в 16 мл ДМФ охлаждают до -10С, при перемешивании прибавляют 1,22 г (9,0 ммоль) изобутилхлорформиата. Реакционную смесь пере мешивают при -10°С 5 мин, затем прибавляют 2,00 г (8,44 ммоль) N-OKCHгрупп пoли-N-oкcиcyкцинимидa; температуру реакционной смеси постепенно доводят до и перемешивают 1 ч при этой температуре. После охлаждения реакционной смеси до комнатной температуры полимер отфильтровывают, промывают метаном, ацетоном, эфиром ,и сушат в вакууме. Получают 2,35 г полимерного эфира. Содержание аминокислоты (определено по привесу на исходный полимер) 1,52 ммоль/г поли„мера. ИК-спектр (V, см): 1740, 1820. В аналогичных условиях получают поли-К-оксисукцинимидные эфиры Вос-Glu, содержание аминокислоты в полимере 1 ,40-ммоль/г, ЙК-спектр (V, см-): 1740, 1820; Tos-Ala, содержание остатков аминокислоты в полимере 1,63 ммоль/г, ИК-спектр (-), см-): 1740, 1820; Boc-Glu(OBZl содержание остатка аминокислоты в полимере 1,55 ммоль/г, ИК-спектр (л), СМ- ): 1740, 1820. Синтез пептидов с помощью предлагаемых полимерных активированных эфи ров. Пример 3. Трет-бутилоксикар бонил-пролил-пролин. К раствору 0,69 г (6,0 ммоль) пролива в 20 мл 0,1 М боратного буфера рН 10,0 прибавляют при перем шивании 2 г (3,02 ммоль) поли-Ы-окс сукцинимидного эфира трет-бутилокси карбонил7пролина и перемешивают реа ционную смесь 1 ч, затем в загустевшую реакционную смесь добавляют еще 5 мл того же буфера, через 2 ч перемешивания при комнатной темпера туре полимер отфильтровывают, промы 1 4 вают водой, фильтрат подкисляют лимонной кислотой До рН 2 и экстрагируют этилацетатом. Этилацетатный слой сушат сульфатом натрия и упаривают в вакууме. .Остаток кристаллизуют из системы эфир - гексан. Выход 0,855 г (90,6%), Т.пл. 187-188°С. Найдено, %: С 57,85; Н 7,73; N 8,50. .. Вычислено, %: С 57,72; Н 7,68; N 8,97. В синтезе использованы полимерактиватор, сшитый 10 мол.% бензидина. П р и м е р 4. Трет-бутилоксикарбонил-пролил-аргинин. К раствору 2,26.г (13,0 ммоль) аргинина в 40 мл воды прибавляют 12,1 г (13,8 ммоль) пoли-N-oкcиcyкцинимидного эфира трет-бутилоксикарбонил-пролина и перемешивают реакционную смесь 48 ч при рН 9,0, поддерживая рН добавлением N-метилморфолина; в процессе реакции добавляют еще 50 мл воды.По окончании реакции полимер отфильтровывают, промывают водой, метанолом. Фильтрат упаривают в вакууме, остаток промывают этилацетатом, эфиром. Кристаллизуют из системы метанол-эфир. Выход 4,10 г (82,0%). Т.пл. 178-183 С. - 48,4 (с 1, метанол). Найдено, %: С 49,44; Н 7,97; N 18,00. X HgO. , С 49,36; Н 7,97; Вычислено, N 17,99. В синтезе использован полимер-активатор, сшитый. 10 мол.% диамино- дифенилоксвда. Пример 5. Амид трет-бутиолоксикарбонил-грицил-триптофил-мети-онил-аспартил-фенилаланина. К 0,80 г (О 1,14 MMOJib) амида трет-бутилоксикарбонил-триптофияметионил-аспартил-фенилалонина-пр ибавляют 13,0 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают раствор 1 ч в токе аргона, продукт осаждают эфиром, фильтруют и промывают эфиром. После высушивания полученный трифторацетат растворяют в 30 мл вода, добавляют 2,4 г триэтиламина и 6,0 г (8,4 ммоль) поли-Н-оксисукцинимидного эфира трет-бутилоксикарбонил-глицина. Реакционную смесь перемешивают 45 ч при рН 8,0 (поддерживают добавлением триэтиламина) и комнатной температуре. Через 20 ч после начала реакции добавляют ,еще 1 г полимерного эфира и 20 мл воды. По окончании реакции полимер отфильтр вывают, промывают водой; фильтрат подкисляю-п концентрированной НС1 д рН 3 и добавляют NaCl до насыщения Выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой, эфиром, высушиваю Выход 0,792 г (91,2%), Т.пл. 192-195°С (с.разл.). 24,2 (с 2, ДМФА). Найдено, %: С 56,38; Н 6,22, N 12,84; S 4,19. CjgH -jNyO S.. Вычислено, %: С 58,36; Н 6,29; N 13,00; S 4,25. В синтеэе использован полимерактиватор, сшитый 10 мол.% диаминрдифенилметана. Полимерные активированные эфиры могут быть использованы многократно Методика регенерации полимера. 5 г полимера, выделенного после проведения аминолиза по примеру 3, поме1цают в раствор 5 г гидроксилагмина в 50 мл воды и перемешивают реакционную смесь 2ч при .. Затем полимер отфильтровывают, промывают водой, 0,5 Н.НС1, водой, адето ном, эфиром, высутвивают в вакууме. Выход полимера 4,95 г. Содержа:ние N-оксигрупп 4,20 ммоль на 1 г полимера. ИК-спектр (rV, см-): 1650, 1710, 1780, 3200-3500. Отсутствуют полосы в ИК-спектре (V, см): 1740, 1820, соответствующие активированному эфиру. Выход и физико-химические константы пептидов, полученных с использованием 2-нитро-4-сульфофениловых эфиров N-защищенных аминокислот (известный способ) и при использовании поли-Ы-оксисукцинимидньк эфиров аминокислот (предлагаемый способ) приведены в таблице. Как видно из таблицы, использование полИН-оксисукцинимидных зфиров аминокислот позволяет получать пептиды высокой стейени чистоты с высоКИМ выходом (до 90%), более высоким ..(на л/20%), чем позволяет-получать известный метод СЗ}. Предлагаемые поли-Н-оксисукцинимидные эфиры аминокислот дают возможность упростить процесс получения пептидов за счет использования высокореакционноспособных полимерных активированных эфиров, которые могут быть использованы многократно, а также за йчет простой процедуры выделения целевого продукта.

Поли-М-оксисукцннимйдные эфиры аминокислот формулы О -71 N-OdOK косо Ь СНз Н(-1Г Hid dHt о ti I К 0.0 где R - остаток N-защищенной -аминокислоты; R- остаток сшивающего агента: бензидина, диаминодифенилоксида, диаминодифенилметана, в качестве реагентов для пептидного синтеза. 00 Од 00 О