Синтетический аналог природного пептида тафцина, обладающий фагоцитозстимулирующей активностью Советский патент 1981 года по МПК C07K5/103 A61K38/07 

.1 .-,

Изобретение относитсй к области синтетических пептидов, а именно к . новому аналогу Природного пептида тафцина формулы

GC-i-Qen-PVO-Av lg -CH COOH-WaO, .

обладающему способностью стимулировать фагоцитоз. Данный аналог тафцина може найти применение в медицине, так как ряд заболеваний (серповидная анемия, миелофиброэ и 4piyfrHe) связан с понижением фагоцитарной ак-. ти.вности лейкоцитбь.

Возможно применение та:фцина вместо -глобулина при лечений инфекционных эаболё:ваний после травматнческих поражений селезенки, cOnposoikдающихся резким понижением кЬлиЧЕестгва 8ыраба ываек огр в организме, тафцина МСзЗл з. :; У:

в настоящее время известны многочисленные синтетические аналоги тафцина , .образованные моДификацйей одно го или двух аминокислотных остазгков молекулы 111и1;4}. Эти аналоги-.в оСт. новном обладают более низкой активностью по сравнению с тафцином. .

Цель изобретения - расширение арсенала средств воздействия на; живой,

. . У 2

организм,создание аналога с равной тафцину биологической активностью,но более nisbcToro и экономичного, чем , тафцин..

. Это достигается описывае м синтетическим аналогом природного Пептида : , тафцина формулы

...: Gitvj-Gen-Pro- V-g-CHi.COOH iHjO,

обладающим фагоцитоз-стимулирующей активностью. Данный аналог , С1 п 1 -тафцин является, подобно, само му тафцину,. фрагментом домена Сц тя. ж-елой Цепи иммуноглобулина человека ii класса TgG с аминокислотной последовательностью 341-344 15.

..Йри определении фагоцитарной ак. , тивностй сегмен оядерных нёйтрофилов

крысы по методике B.C. Гостева 2& и др. найдено, что представляемое .сое;Е1Инение активирует фагоцитоз в той е степени, что и сам тафцин (табл.1

;. и ,2)-. - : .

Согласно этой методике для опытов

25 берут кровь крысы, разведенную 2%-ным лимонйокислым натрием та отношении 1:1 и. изучаемых соединений. В . .контрольных опытах используют изото;:мйческий раствор Хлорида натрия. До3() .бавЛяют суточную культуру коагулазопозитивного патогейног1Э штамма STaphy i ососсис: aureus в концентрации 1 млрд в 1 мл. Смесь инкубирую в tep мрстате при 37 С в течение 30 мин.За темприготовляют мазки, фиксируют ме танрлом по Ромайовскому-Гймза, Подсчитывают 100 сегментоядерных нёйтро филов, определяют из них число погло тивших бактерий (% активных фагоцитов) и среднее количество ба ктерий в одном сегментоядёрном нейтрофиjie фагоцитарное число .Фагоцитарные показатели приведены в табл. 1, . . . ..,,Преимуществом описываемого соеди:нения являетсй применение более дёшё Biax и доступных аминокислот по срав/нению с тафцином (нап гмер; замена ;треонина на более чем в 50 раз деше :вый глиций) . Процебс синтеза fcty, -СЕп 3-тафдина менее трудоемок, ак как не требует введения дополни-. тельных защитных группировок для гид роксилъной функции треонина, гуанидй , новойфункции аргинина и т.д. что упрощает иудешевляет возможный его промы11шенный синтез. ... . . Cciy, GEn J-тафцйн синтезируют известным методом З и 4} ступенча тыМ нарШийаНиеМ пептидной Цели с С-конца по приведенной схеме. Гуанидинокую группйрЬвку аргинина защищаю .(рбразованием внутренней соли „ чем ,до Ьтигают изащиты его карбоксильной функций. Аминокислоты приеоединйют. в виде бензйЛоксикарбонил- или трет бу илоксйкарбонилпройзводнах активйров.анных эфиров. Снятие защит на стадиях дипептида и трипептида осу. а ествляют НВг/леА и НС г/лед СН С ООН соответственно. Очистку продукта проводят на стадии эащйщенцого тет апётгтида хрсэматографировайиём йа силик геле. После снятия бей зилоксйкарбонйльйой -руппы гидрировани.ем над палладием получают чистый продукт. .. ; ,. для синтеза., нового соединения {1-глицин, 2-глутамин)-тафцина использую аминокислоты и их производные фирмы Реанал, Венгрия. Все ами нокислоты, кроме глици.на, 1-конфиГУРйции. Температуры Плавления, определяемые в открытых капиллярах, приведены без поправок. Гомогенност полученных соединений проверяют на лластинках Eastman. ПрйёедейЫ хроматографические, подвижности R-f-. следующих системах: А - езензол этйлацетат - уксусная кислота (30:10 :0,5) ; Б - н.бутанол - этанол - вода - уксусная кислота (80:10:30:5); В - й-бутанол - пиридин - вода - уксусная кислота (30:20:24:6); Г н.бутанол - вода - уксусная кислота (4:1:1), а также электрофоретичесхая j. одвижнос -ь по отнесению к гистядиу. . ; Схема синтеза (1-глицин, 2-глутаМин( -таФдйна на бумаге FN-15 в 1н. (рН 2,4) и 5н. (рН 1,4) уксусной кислоте. Углы вращения определяли на поляриметре Perk in Elmer 141. Для всех соединений данные злементного анализа удовлетворительно совпадают с вычисленным содержанием С, N, Н. Строение пептида подтверждают аминокислотным анйлйзом, который выполняют йа анализаторе ВiосаЕ -200 после гйдрблйза пептида в запаянной ампуле при в течение 24 ч. Пример синтеза. Бензилоксикарбонил-пропнл-аргинйн (1). iC 4,00 г (11 ммоль) р-нитрофенилового эфира бензилоксикарбонил-пролийа в 70 мл диоксана при перемешивании добавляют 1,57 г (9 ммоль) аргинина в 40 МП воды. Образовавшийся раствор перемещивают 2 , затем упарнвают в вакууме () досуха и раствЬряют остаток в 15 мЛ диметилформамида. Раствор перемешивают еще 24 ч, затем прибавляют 10.0 мл этилацетата и выдерживйют 6 ч в холодильнике.Обрадовавшийся осадок отфильтровывают, промывают тйлацетатом, эфиром. После перекристаллизации из абсолютного зтайопа и эфира выход чистого продукта 3,47 г (-95%), т.пл. 137-140С, -46,6 (С1, НгО) ; R 0,00 (А), 0,53 (Б), 0,66 (В), 0,65 (Г), 0,5-6 (рН 2,4). трет-БутиЯоксикарбонил-глутамил-пролил-аргйнин (3). 3,35 г (8,3 ммоль) бензилоксикарбонил-пролил-аргинина (1 растворяют в 10 МП ледяной уксусной кислоты и добавляют 10 мл 4н. НВг/лед . Через 1 ч уйаривают смесь досуха в вакууМе () и образовавшееся масло растирают под эфиром дополучения твердого вещества, сушат при 1- мм рт.ст. над едким .кали. Затем растворяют его в 100 мл воды и обрабатывают и.ояоое5менной смолой АВ 17x8 (15 мл) для получения свободного пролйл--аргййина (2). К раствору его в 20 мл воды прибавляют при перемешивании раствор 4,05; г (11 ммоль) р-нитрофёнидового эфира трет-бутилоксикарбонил-глутамина в 45 мл диоксана.

Через 2 ч раствьритель упаривают в вакууме () и остаток расТво5 яют в 20 Mrt диметилформамида, раствор перемешивают 48 ч, ггрибавяяют к нему 200 мл этилацетата и вьадержйвают S холодильнике сутки i Выпавший осадок отфильт ровывают, промывают этилайетатом, эфиром.Выход 3,74 г(79%) , аморфн., ки. Выпавший осадок отфидьтр6выйают, промывают этилацётатбм, эфиром.Выход 3,74 г (79%); аморфн., cijS-64,7(С1, НгО); Кг 0,00 (А),

0,37 (Б), 0,58 (В), 0,59 (Г),Ещз 0,54 (рН 2,4) . , .

Пентафторфениловый эфир бензилоксикарбонил-глиЦина (4).

К раствору 6,30 г (36 ммоль) бензилоксикарбонил-глицина в 160 мл этилацетата прибавляют при перемешивании 6,60 г (36 ммоль) пентафторфенола в 30 мл этилацетата. Раствор охлаждают до и добавляют 7,40 г (36 ммоль) дициклогексйлкарбодиимйда в 30 мл этилацетата. Реакционную смесь вьадерживают 1 ч при., затем 10 ч при комнатной температуре,отфильтровывают дициклог ексилкарбамид, упаривгиот этилацетат до ббъемаЮ прибавляют 200 мл гексана и вадер жй- вают в ,холодильнике 72 ч. выпавшие кристаллы отфильтровывают, п зомывают гексаном. Выход 10,30 г (9:2%); т.пл. Sl-ea C, Rf 0,89 (А), 0,88 (В), 0,78 (В), 0,89 (Г). . .

Бензилоксикарбонил-глицил-глутамил-пролил-аргинин (6).

3,00 г (5,7 ммоль) трет-бу.тилоксикарбонил-гЛутамил-проЛил-аргинина(3) растворяют в 20 мл ледяной уксусной кислоты и добавляют 20 мл (20 ммоль) 1н. . СHjCOOH,. выдерживают при комнатйой температуре 1ч, упаривают в вакууме () досуфагоцитарные показа ели лейкоцитов после воздействия тафцина

ха, образовавшееся масло растирают под 200 мл эфира до образования твердого вещества, выдерживают его 2 ч при 1 мм рт.ст. над едким кали. Затем растворяют в 100 мл воды и обрабатывают ионообменной смолой АВ 17 X 8 (15 мл) для получения свободного глутамил -Пролил-аргинина (5). К раствору трипептида (5) в 6 мл воды добавляют при перемешивании 2,50 г (6,2 ммоль) пентафторфенилового эфира бензилокснкарбонил-глицина (4) в 20 МП диоксана. Выдерживают раствор

2ч при комнатной температуре, упари.вают растворитель в вакууме () досуха -и bcTaTok растворяют в 8 мл

5 диметилфррмс1мида. Перемешивают образовавшийся раствор 48 ч, добавляют.. 200 МП этилацетата, образовавшийся осадЬк отфильтровывают, промывают 80 мл атйлацетата и 10 мл эфира.Вы0ход 2,94 г (87%). Вещество очищают на сйликагеле (колонка 30x600) в системе В. Выход чистого продукта 1,71г (51%) ; Ect 3%°-63( С1, 5%СНэСрОН);

,Ri 0,001 (А). 0,35 (Б), 0,ь4 (В), 5 ,0, 5Ь-1Г), Ен|5 0,50 (рН 2,4).

(1-глицин, 2-глутамин)-тафцин (7). 6;,66 г (1,1 ммоль) бензилоксикарбонил-глициЛ-глутамил-пролил-аргинина (6) гидрируют при ат лосферном давлении в присутствии палладиевой черНи в смеси 20 мл метайола и 0,1 мл уксусйой кислоты в течение 32 ч. Упаривают, растирает под эфиром.Сушат |над пйтиокисью фосфора при 1 мм рт.ст продукт электрофоретйчески и хромато графически однородный. Выход 0,45г (86%), т.пл. (с разл.); )-77 (С 0,6, 5% CHjCOOH); R « 0,00 (А), 0,08 (Б), 0,18 (в), 0,15 (Г), Ёи« 0,92 (рН 1,4) . Т а б л и ц а 1 Крови (сегментоядерных нейтрофилов) и (1-глицин, 2-глутамин -тафцина)

% Активных 76,0 -81,2 фагоцитов

Фагоцитарное

5,4

число4,6

7,0 9,0 7,7 6,8

4,9

8,9 7,1 82,6 66,0 81,3 86,4 86,0 73,0

- . - . . ., . - , - . т .а 6л и ц а 2

Исследования фагоцита УЙЗй-.актййности сегментоядерных лейкоцитй§ ке)бвй крысы при воздействии.тафцадаЧ аналога тафцина - соединения Gty-GIn-Pro-Arg f eHgCOOH-ЗН.О

1,54 2,29 2,05

2,23 33,6 32,8 il p и м e ч a н и е: -.,:

Формула изобретения

Синтётйчёский аналог природного пептида тафцина формулы

.Gev-Qtn-Pvo-A -C.H COOH-3H20

Обладающий .фагоцитоз-стимулирующей активностью.

; Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

p. 3161-3170.

B (ocheftii stry, 1970, v. 9, № 16, e. 3197-3205..

1,91

2,45 2,21

29,7

39,3 38,2

S i emi on J.Z., SIbpek S., Szymam i ec S t Kionowcka E., Partial seguences of histones With tuftsin actiVity . 3nt. a.Peptide Protei n Res. 1977, V. 9, f 1, p. 71-77.

6v Гостев B.C., Петряшина.M.H.,П6повкина С.A., A.К. Фагоцито.з, комплекты и свёртывание крови при недостатке бёлкв: в пище В кн. Вопросы питания. Труды АМН СССР, т.13, вып. 2, М., 1950, с. 110-116. А - количество Ъактерий в одйом сегментоядерном нейтрофиле при воздействии препаратов; Aj - количество бактерий в Ъдном сегментоядерном ней рофиле в контроле; . : Р - число активных фагоци ов при воздействии препй- рата; ; , - ;. - . ..,.. , / . . . Рц число активных фагоцитов в контроле.