Способ получения сульфатов пептидил-аргининальдегидов Советский патент 1988 года по МПК C07K5/87 A61K38/06 

Изобретение относится к способу получения сульфатов пептидил-альде- гидов - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретения - создание новых соединений пептидной природы, обладающих селективным торможением свертывания крови, но более ста-.

бильных и не проявляющих склонности к необратимой циклизации.

Rp-значения определяют с помощью хроматографии в тонком слое на сили- кагеле (Kieselgel G Реанал, Буда- пешт) при применении в качестве элю- ирующего средства смеси растворителей. Этиловый эфир уксусной кислоты пиридин, уксусная кислота и вода при соотношениях (960:20:6:11);

(480:20:6:11); (240:20:6:11); (120: :20:6:11); (60:20 :6: 11); (30:20:6: :11).

Пример 1. Сульфат Ы-метил- -D-фенилала нин-L-np олил-L-apr инин- альдегида.

Стадия 1. К-Бензилоксикарбонил- -Н-метил-В-фенилаланин-Ь-пролил-К - -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-лак- там.

42,95 г (0,11 моль) N-трет-бути- локсикарбонил-N -бензилоксикарбо- нил-Ь-аргинин-лактама суспендируют в 110 мл безводного хлороформа, после чего суспензию при перемешивании смешивают с 275 мл раствора хлористго водорода в этиловом эфире уксусной кислоты (концентрация 0,11- 0,15 г/мл). После перемешивания в течение 3 ч реакционную смесь раз- бавляют прибавлением 400 мл диэти- лового эфира, выделившуюся в осадок кристаллическую массу Отфильтровывают, два раза промывают осадок диэти ловым эфиром, применяя каждый раз п 100 мл последнего, а затем промывают два раза ацетоном , применяя каждый раз по 50 мл последнего. Затем продукт сушат в вакуумном эксикаторе над пятиокисью фосфора и гидроокисью, калия. После сушки приблизительно в течение 1 ч соединение расворяют в 100 мл диметилформамида, приготовленный раствор охлаждают до -15 С, после чего при указанной тем пературе и при перемешивании прибав ляют в раствору сначала 20 мл, а затем 10-15 мл триэтиламина таким образом, чтобы в газовой фазе нельз

5

0

0

5 0 5 г

0

было обнаружить перетекание основания. Ссупензию прибавляют к указанному ниже смешанному ангидриду.

50,9 г (0,1 моль) циклогексилам- монийной соли N-бензилоксикарбонил- -К-метил-В-фенилаланин-Ь-пролина растворяют в 200 мл диэтилового эфира и 120 мл 1 н. раствора серной кислоты. Фазу диэтилового эфира три раза промывают водой, применяя каждый раз по 30 мл последней, сушат над безводным сернокислым натрием, а затем упаривают на водяной бане при и давлении 25-30 мбар. Получен- ньш остаток и 11,2 мл (0,1 моль) N-метилморфолина растворяют в 70 мл диметилформамида, раствор охлаждают до--15 С, после чего при указанной температуре смешивают с 13,2 мл (0,1 моль) изобутилоксикарбонилхло- рида. Затем (через 3-5 мин) смесь дополнительно перемешивают в течение 5 мин, после чего к полученному :смешанному альдегиду прибавляют указанную суспензию в диметилформами- де. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при и в течение 1 ч при 0°С, затем смесь разбавляют прибавлением 200 мл бензола, после чего вьщеливашийся в осадок кристаллический продукт отфильтровывают .

Раствор продукта в бензоле и ди- метилформамиде разбавляют прибавлением 150 мл воды, после чего производят разделение фаз. Нижнюю, содержащую воду,- диметилформамидную фазу три раза экстрагируют бензолом, применяя каждый раз по 50 мл последнего. Объединенные бензольные растворы три раза промывают водой, применяя каждый раз по 30 мл последней, сушат над безводным сернокислым натрием, а затем упаривают на водяной бане при температуре, составлякщей максимум 40°С, и давлении 20-25 мбар.

Полученный маслообразный остаток растворяют в 60 мл смеси, состоящей из бензола и тетрагидрофурана (8:2), после чего раствор хроматографиру- ют на колонке, заполненной 750 г силикагеля-60, при применении в качестве элюирующего средства той же самой смеси растворителей. Фракции анализируют с помощью хроматографии в тонком слое на силикагеле при применении в качестве элюирующего средства смеси растворителей, состояш;ей

из этилового эфира уксусной кислоты пиридина, уксусной кислоты и воды 480:20:6:11. Целевой продукт имеет Rp-значение 0,70-0,76. Фракции, в которых содержится чистый основной продукт, объединяют и упаривают на водяной бане при температуре, сос- тавляющей макс11мум 0°С, и давлении 20-25 мбар до объема 100 мл. Полученный концентрат смешивают с 500 м петролейного эфира. Образовавшуюся суспензию фильтруют, остаток на фильтре два раза промывают петролей ным эфиром, применяя каждый раз по 100 мл последнего, и затем сушат в вакуум-эксикаторе над серной кислотой и Парафиновыми стружками.

.Выход 45 г (65%). о +13,5 (с 1 , тетрагидрофуран) . ,70- О ,76.

Вычислено, %: С 65,08; Н 6,20; N 12,31.

C3,H,,0,N, (682,75)

Найдено, %: С 65,4; Н 6,4; N 12,1.

Стадия 2. N-Бензилоксикарбонил- -Ы-метил-В-фенилаланин-Ь-пролил-М - -бензилоксикарбонил-Ь-аргининальде- гид,34,15 г (0,05 моль) N-бензилокси карбонил-К-метил-В-фенилаланин-Ь- -пролил-N -бензилоксикарбонил-Ъ-арг нин-лактама (пример 1, стадия 1) растворяют в 150 мл тетрагидрофура- на, после чего приготовленньш раствор при перемешивании смешивают с 0,0375 моль литийалюмннийгидрида в тетрагидрофуране. Процесс восстановления контролируют с помощью хроматографии в тонком слое при применении в. качестве элюирунлцего средства смеси растворителей, состоящей из этилового эфира уксусной кислоты, пиридина, уксусной кислоты и воды 240:20:6:11, (R р- значения для лак тама и альдегида составляют соответственно (-0,,5). В случае необходимости прибавляют дополнительное количество литийалкминийгидрида. Затем при перемешивании и охлаждении рН реакционного раствора доводят до значения 2 посредством прибавления 1 Н. раствора серной кислоты. Раствор разбавляют водой до появления опалесценции (приблизительно 300 мл), а затем два раза производя экстрагирование гексаном, применяя каждый раз по 100 мл последнего. Со0

5

0

держащий воду, тетрагидрофурановый раствор два раза экстрагируют при применении 250 нп метиленхлори- да, объединенные метиленхлоридные э кстракты последовательно промывают два раза водой, применяя каждый раз по 50 мл последней, два.раза 5%-ным раствором кислого углекислого натрия, применяя каждый раз по 60 мл этого раствора, и вновь два раза водой, применяя каждый раз по 50 мл последней, сушат над безводным сернокислым натрием, а затем упаривают на водяной бане при температуре, составляющей максимум , и давлении 20-25 мбар до объема 50-60 мл. Остаток смешивают со 100 мл бензола, а затем упаривают описанным способом. Полученный остаток разбавляют прибавлением 100 мл циклогекса- на, образовавшийся осадок отфильтровывают, цромывают два раза циклогек- саном, применяя каждый раз по 30 мл 5 .последнего, а затем сушат в вакуум- эксикаторе над парафиновыми стружками.

Выход 27 г (70%) продукта, который в соответствии с данными элементного анализа, содержит 1 моль циклогексана. R 0,52-0,62. +16,-8°(с 1, тетрагидрофуран) .

Вычислено, %: С 67,16; Н 7,34; N 10,93.

С5,Н„О.К,-С,Н,г(768,93)

Найдено, %:С66,6;Н7,2; N 10,4.

Стадия 3. Сульфат Ы-метил-В-фе- нилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальде- гида .

23,1 г (0,03 моль) N-бензилокси- карбрнил-Ы-метил-В-фенилаланин-Ь- -пролил-N -бензилоксикарбонил-L-ap- : гининальдегида (пример 1, стадия 2) растворяют в 150 мл этилового спирта. Приготовленный раствор смешивают с 50 мл обессоленной нонирова- нием воды, 48 мл 1 н. раствора сер ной кислоты и 3 г 10%-ного палладия на угле, применного в качестве катализатора, и производят гидрирование,. Процесс гидрирования контролируют с помощью хроматографии в тонком слое при применении в качестве элю- ирующего средства растворителей, состоящей из этчаового эфира уксусной кислоты, пирчцина, уксусной кислоты и воды в соотношении

0

5

0

5

0

5

30:20:6:11 (R - значения исходного соединения 0,9, промежуточного продукта 0,7 и конечного продукта 0,4) После завершения.реакции катализатор отфильтровывают и промывают его три раза обессоленной ионизированием водой, применяя каждый раз по 30 мл последней. Объединенные фильтрат и полученную при промывке жидкость упаривают на роторном испарителе до объема 100 мл. Водный остаток разбавляют обессоленной ионированием водой приблизительно до 200 мл. Если значение рН не находится в пределах между 6jO и 6,5, то его приводят к этому пределу посредством прибавления О, н. раствора серной кис- jiOTbi, ионообменника в ОН-форме (например, AG 1X8). Непосредственно после этого осуществляют лиофилиза- цию.

выход 12,4 г (75%). 0,39- 0,47. -13Г (с 1, вода).

Вычислено, %: С 46,07| Н 7,13; N 15,35; S 5,12.

С,,Н520зНб 7/8 () - 2,5 () (547,37)

Найдено, %;С46,4;Н7,2; N 15,05; S 5,0. ,

Исходные вещества получают следующим образом,

Ы-Бензилоксикарбонил-К-метил-В- фенилаланин-Ь-пролин.

Стадия А. 2,4,5-Трихлорфенило- вый эфир бензилоксикарбонил-В-фенил- аланина.

60,0 г (0,2 моль) бензилоксикар- бонил-В-фенилаланина и 39,4 г (0,2 моль) 2,4,5-трихлорфенола растворяют в 200 мл тетрагидрофурана, раствор охлаждают до 5-10 С, после чего охлажденный раствор при перемешивании смещивают приблизительно в течение 30 мин с 41,2 г (0,2 моль) дициклогексилкарбодиимида, затем реакционную .перемешивают в течение 6 ч без охлаждения. Выделившийся в осадок дициклогексилкарба- мид отфильтровывают, три раза промывают его тетрагидрофураном, применяя каждый раз по 50 мл последнего, и объединенные тетрагидрофура- новые растворы упаривают в вакууме. Полученный остаток перекристаллизо- вывают из горячего этилового спирта кристаллический продукт отфильтровывают, два раза прбмывают при 5-10°С этиловым спиртом, применяя каждый

0

5

0

5

0

5

0

5

0

139Д1 метил3,79;

раз по 50 мл последнего, и сушат в вакуум-эксикаторе.

Выход 72 г (75%) , т. пл. 141°С. +37° (с 1 формамид),

Вычислено, %: С 57,70; Н N 2,92; С1 22,22.

(478,75) Найдено, %: С 57,7; Н 3,9; N 3,0; С1 22,2.

Стадия В. Бензилоксикарбонил-D- -фенилаланин-Ь-пролин.

71,8 г (0,15 моль) 2,4,5-трихлор- фенилового эфира бензилоксикарбо- нил-С-фенилаланина (пример 1, стадия А) растворяют при перемешивании и комнатной температуре в 180 мл безводного пиридина, а затем приготовленный раствор смешивают с 17,3 г (0,15 мо ль) L-пролина и 21,0 мл (0,15 моль)триэтиламина. Перемешивание продолжают до полного растворе-, ния L-пролина. Затем реакционную смесь вьздерживают в течение 4-6 ч, непосредственно после этого ее упаривают до объема 80-100 мл на водяной бане при температуре, составляющей максимум 40°С, и давлении 13- 20 мбар, после чего остаток смешивают с 250 мл воды и 90 мл диэтило- вого эфира. Водную фазу два раза экстрагируют диэтиловым эфиром, применяя каждый раз по 30 мл последнего , объединенные эфирные растворы два раза промывают 5%-ным раствором кислого углекислого натрия, приме- ; няя каждый раз по 30 мл этого раствора, а затем объединенные водные . растворы подкисляют до рН 2 посредством прибавления 3 н. раствора соляной кислоты. Выделившееся в осадок маслообразное вещество три раза экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, применяя каждый раз -по 120 мл последнего, объединенные растворы продукта в этиловом эфире уксусной кислоты три раза промывают водой, применяя каждый раз по 40 мл последней, сушат над безводным сернокислым натрием, а затем упаривают на водяной бане до 50-100 мл при температуре, составляющей максимум 40°С, и давлении 15-20 мбар. Полученный остаток перекристаллизовыва 5 ют из 200 мл диэтилового эфира.

Кристаллический продукт отфильтро- Бывают, два раза промывают диэтиловым эфиром, применяя каждый раз по

7

АО мл последнего, и сушат хе.

Выход 50,4.г (85%). Т. 133°C. -46,4 (с тилформамид). R р 0,5.

Вычислено, %: С 66,65; N 7,07

(396,43)

Найдено, %: С 66,4; Н 6,25, N 7,2.

Стадия С. Циклоге ксиламмонийная соль К-бензилоксикарбонил-Н-метил- -В-фенилаланин-Ь-пролина.

39,6 г (0,1 моль) бензилоксикар- .бонил-В-фенилаланин-Ъ-пролина (пример 1, стадия В) и 50 мл (0,8 моль) йодистого метила растворяют в 300 мл безводного тетрагидро фурана. Приго- товленньш раствор охлаждают до О С, после чего при перемешивании при-, бавляют к нему порциями 13,2 г (0,3 моль) гидрида натрия, причем количество порций составляет 8-10, затем перемешивание продолжают при комнатной температуре в течение 2 ч. Непосредственно после этого к реакционной смеси прибавляют 500 мл этилового эфира уксусной кислоты с целью .разложения образовавшейся гидроокиси натрия, и дополнительно осторожно прибавляют еще 10 мл воды для разложения избыточного количества гидрида натрия. Затем раствор упаривают на водяной бане при температуре составляющей максимум 40°С, и давлении 15-20 мбар. Остаток растворяют в 250 мл воды и 100 мл диэтилового эфира, водную фазу промывают 100 мл диэтилового эфира, после чего объединенные эфирные растворы промывают 50 мл 5%-ного раствора кислого углекислого натрия. Раствор кислого углекислого натрия и водную фазу объединяют, подкисляют прибавлением 5 н. раствора сернокислого калия до рН 2, а затем два раза экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, применяя каждый раз по 150 мл последнего. Объединенные растворы продукта в этиловом эфире уксусной кислоты поН следовательно промывают 100 мл воды, 50 мл 10%-ного раствора тиосульфата натрия, повторно 100 мл воды, сушат органическую фазу над безводным сер нокислым натрием, а затем упаривают на водяной бане при температуре, составлянщей максимум , и давлении 15-20 мбар. Полученный остаток

5

0

5

растворяют в 600 мл бензола, раствор смешивают с 12 мл (0,105 моль) цик- логексиламина, после чего смесь выдерживают в течение ночи при комнат- ной температуре, Выделившийся в осадок кристаллический продукт отфильтровывают, два раза промывают бензолом, применяя каждый раз по 200 мл п последнего, и затем сушат в вакуум- эксикаторе над парафиновыми стружками.

Выход 38,2 г (75%). R 0,53- 0,60 (циклогексиламин 0,01-0,05). Т. пл. 160-163°С. Г«( 7д +12,1° (с 1., метиловый спирт) .

Вычислено, %: С 68,34; Н 7,71; N 8,25.

C23H2f05-N2-Cj,H,3N (509,63).

Найдено, %: С 68,5; Н 7,8; N 8,3..

N -трет-Бутилоксикарбонил-N -бен- зилоксикарбонил-Ь-аргинин-лактам.

Стадия Д. Гидрат N-трет-бутилок- сикарбонил-К -бензилоксикарбонил-Ь- аргинина,

65,8 г (0,2 моль) гидрата хлор- гидрата трет бутилоксик арбонил-Ь-аргинина растворяют в 100 мл 4 н. раствора гидроокиси натрия, приготовленный раствор охлаждают до 5- , затем при перемешивании его смешивают с 80 мл (0,5 моль) бензил- оксикарбонилхлорида и с мл 4 н, раствора гидроокиси натрия так, чтобы значение рН раствора было выше 12. Непосредственно после этого ре акционную смесь дополнительно перемешивают в течение 3-4 ч, затем разбавляют ее прибавлением 150 мл воды, после чего п эоизводят экстрагирование 100 мл диэтилового эфира. Образовывалось три фазы. Две нижние фазы еще два раза промывают диэтиловым эфиром, применяя каждый раз по 100 мл последнего, смешивают с 300- 400 мл метилового спирта для того, чтобы гомогенизировать фазы, после чего значение рН раствора, если необходимо, доводят до 12 (прибавле- 0 .нием 4 н. раствора гидроокиси натрия) . Раствор выдерживают в течение 6-8 ч, а затем его два раза экстрагируют смесью диэтилового эфира уксусной кислоты и петролейного эфи- 5 ра, взятых в соотношении 1:1, значение рН прибавлением ледяной уксусной кислоты доводят до 6-7 (прибли- ;зительно 50 мл), три раза производят

0

5

0

5

экстрагирование хлористым метиленом, применяя каждый раз по 140 мл последнего. Растворы продукта в хлористом метилене объединяют, два раза промывают водой, применяя каждый раз по 60 мл последней, а затем упаривают на водяной бане при и- давлении 25-30 мбар. Полученный остаток смешивают с 300 мл бензола и.600 мл смесь в течение 2-3 ч переме20°С, затем вьщерживают в течение ночи при . Выделившийся в осадок кристаллический продукт отфильтровывают, промывают последовательно 300 мл воды и 300 мл бензола, после чего сушат в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора и дарафиновыми стружками.

Выход 60 г (70%). Т. пл. 122- 124 С. -20 7° (с 1, пиридин) . .

воды, шивают при

С 53,51; Н 7,09;

gH280 N4-H20 (426,46)

С 53,35; Н 7,2;

Вычислено, 13,14. С

IV.

Найдено, % 13,1.

Стадия Е. N тpeт-Бyтилoкcикapбo- нил-lSn-бeнзилoкcикapбoнил-L-apгининлактам.

59,7 г ,( моль) гидрата N - трет-бутилоксикарбонил-Ы -бензилок сикарбонил-Ь-аргинина :(пример 1 , - стадия Д) и 19,6 г (0,14 моль) три- этиламина растворяют в 200 мл тетра- гидрофуран а. Приготовленный раствор охлаждают до -10°С, после чего при указанной температуре и при перемешивании его смешивают сначала с 18,5 мл (0,14 моль) изобутилокси- карбонилхлорнда, а затем через 10 мин с 19,6 мл (0,14 моль) три- .этиламина. Реакционную, сме.сь перемешивают в течение 1 ч при 0°С и еще в течение 1 ч без охлаждения, причем после завершения перемешивания смесь выливают в 1 л ледяной воды. Выделившийся в осадок кристаллический продукт отфильтровывают, два раза промывают его ледяной водой, применяя каждьш раз по 100 мл последней, и непосредственно после этого растворяют в 280 мл хлороформ Хлороформный раст.вор промывают 100 мл ледяной воды, сушат над безводным кальцием и при температуре максимум 40°С и да влении 20-25 мбар упаривают -на водяной бане. Кристал-

38420310

лический остаток суспендируют в 70 мл петролейного эфира, продукт отфильтровывают, два раза промывают петролейным эфиром, применяя каждый раз по 30 мл последнего, и сушат в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора.

Выход 44 г (81%) . Т пл. 164- 166°С. -24° (с 1, тетра- гидрофуран).

%: С 58,44; Н .6,71;

10

15

20

25

30

40

35

45

50

55

N

N

. (390,43)

С 58,7; Н 6,8;

Вычислено, .14,45.

С„Нг,0,гМ.

Найдено,- %; 14,1.

Пример 2. Сульфат N-этил- -В-фёнилаланин-Ъ-пролил-Ь-аргинин- альдегида.

Стадия 1. N-Бензилоксикарбонил- . -К-этил-Ь-фенилаланин-Ь-пролил-Н - -бензилоксикарбонил-Ъ-аргинин-лак- там. . .

2,1 г (0,005 моль) N-бензилокси- карбонил-Ы-этил-В-фенилаланин-Ь-про- лина и 2,15 г (0,0055 моль) N -трет- .-бутилоксикарбонил-N -бензилоксикар- бонил-Ъ-аргинин-лактама (пример 1, стадия Е) вводят во взаимодействие или в реакцию конденсации (по способу, описанному в примере I, стадия 1) , при применении пропорциональных количеств реагента и растворителей; При обработке реакционной смеси и во время хроматографии на колонке фракции исследуют с помощью хроматографии в тонком слое .при применении в качестве элюирующего средства смеси бензола и толуола (8:2). Фракции, которые содержат чистый основной продукт (Rр 0,4-0,5), объединяют, упаривают на водяной бане . при температуре 40 С и давлении 15- 20 мбар, остаток обрабатывают диизо- пропиловым эфиром, отфильтровывают, промьшают диизопропцловым эфиром и сушат в ваку ум-эксикаторе над серной кислотой и парафиновыми стружками.

Выход 1,9 г (54%). Rj. 0,75- 0,85.

Стадия 2. N-Бензилоксикарбонил- К-этил-В-фенилаланин-Ь-пролил-К - -бензилоксикарбонил-Ь-аргининальде- гид. .

1,4 г (0,02 моль) N-бензилокси- карбонил-К-этил-В-фенилаланин-Ь-про- лил-к -б бнзилоксикарбонил-Ь-аргинин- лактама (пример 2, стадия 1) вводят во взаимодействие аналогично приме-

ру 1, стадия 2, при применении пропорциональных количеств реагентов.

Выход 1,15 г (72%) продукта, который в соответствии ,с данными элементного анализа содержит 1 моль

циклогексана.

содержит RF

0,55-0,65. С 67,49; Н 7,47;

3,5 (Н)

10

25

30

Вычислено, N 10,73.

CjeH4607N6 CgH,2(782,95)

Найдено, %: С 67,6; Н 7,5; N 10,5.

Стадия 3. Сульфат К-этил-В-фенил- аланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида.

0,78 г (0,001 моль) N-бензилокси- 15 карбонил-К-этил-В-фенилаланин-Ъ-про- лил-N -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин- альдегида (пример 2, стадия 2) вводят во взаимодействие аналогично примеру 1, стадия 3, при применении 20 пропорциональных количеств реагентов и растворителей.

Выход 0,75 г (70%). Rp 0,4-0,5.

Вычислено, %: С 45,93; Н 7,48; N 14,61; S 4,64. С25Нз40зНй- 5/6 () (573,27).

Найдено, %:С46,1;Н7,6; N 14,2; S 4,6.

Исходное соединение, а именно N-бeнзилoкcикapбoнил-N-этил-D-фeнил- аланин-Ь-пролин, может быть получено следующим образом. .

Стадия А. К-этил-В-фенилаланин.

8,25 г (0,05 моль) D-фенилалани- на растворяют в 100 мл 20%-ного водного этилового спирта. Приготовленный раствор смешивают с 5,65 мл (0,1 моль) уксусного альдегида и 2 г 10%-ного палладия на угле, примененного в качестве катализатора, после-чего в течение 2 дн. прои:зво- дят гидрирование. Затем катализатор отфильтровывают, промывают его 60.мл 2 Н, раствора соляной кислоты, после чего рЛ водного раствора доводят до значения 7 посредством прибавле- ния 4 к. раствора гидроокиси натрия, Бьщелившийся в осадок продукт отфильтровывают, три раза промывают, водой, применяя каждый раз по 20 мл последней, и сушат в вакуум-эксикаторе над безводным хлористым кальцием.

Выход 4,85 г (50%). -53° (с 1,.0,1 Н. раствор гидроокиси натрия),

Вычислено, %: С 68,37; Н 7,82; N 7,25.

35

40

45

50

55

0

5

0

5 0

5

0

5

0

5

C,,H,,0,N (193,24)

Найдено, %: С 68,5; Н 7,65; N 7,2.

Стадия В. N-Бензилоксикарбонил- -N-этил-D-фeнилaлaнин.

2,9 г (0,015 моль) Ы-этил-В-фе- нилаланина (пример 2, стадия А) растворяют в 22,5 мл 2 Н. раствора гидроокиси натрия. Приготовленный раствор смешивают сначала с 10 мл диок- сана, а затем после охлаждения до 5-10°С с 2,5 мл (приблизительно 0,017 ) бензилоксикарбонилхлори- да, после чего реакционную смесь перемешивают при охлаждении в течение 3 ч. После этого реакционную смесь разбавляют прибавлением 40 мл воды, а затем производят экстрагирование 30 мл смеси, состоящей из диэтилово- го эфира и петролейного эфира в соотношении 1:1. В результате получают трехфазную систему. Две нижние фазы вновь экстрагируют 300 мл ди- этилового эфира, и объединенные водные фазы подкисляют 1 н. раствором серной кислоты (рН 2). Выделившийся в осадок продукт три раза экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, применяя каждый раз по 30 мл последнего. Растворы продукта в этиловом эфире- уксусной кислоты объединяют, два раза промывают водой, которую каждый раз берут в количестве 20 МЛ-, сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают затем на водяной бане при температуре, сос- .тавляющей максимзад 40°С, и давлении 15-20 мбар.о

Выход 2,7 г (55%) маслообразного продукта. RP 0,5-0,6.

Стадия С. N-бензилоксикарбонил- -N-этил-B-фeнилaлaнин-L-пpoлин.

2,6 г (0,008 моль) N-бензилокси- .карбонил -К-этил-В-фенила ланина (пример 2, стадия 2) растворяют в 10 мл тетрагидрофурана. Приготовленный раствор при 0°С смешивают с 1,6 г (0,008 моль) 2,4,5-трихлорфенола и 1,65 г (0,008 моль) дициклогексил- карбодиимида, после чего реакционную смесь выдерживают в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь фильтруют и фильтрат упаривают на водяной бане при температуре максимум 40°С и давлении 15-20 мбар. Полученный остаток растворяют в 40 мл бензола, раствор промывают два раза 5%-ным раствором

15

20

кислого углекислого натрия, применяя каждый раз по 20 мл этого раствора, два раза водой, которую каждый раз берут в количестве 20 мл. Непосредственно после этого раствор сушат над сернокислым натрием и затем упаивают на водяной бане при температуре максимум 40°С и давлении 15- 20 мбар. Маслообразный остаток раст- Q воряют в 10 МП пиридина, раст- вор смешивают сначала с 0,92 г (0,008 моль) ,Ь-пролина, затем С; 1,12 МП (0,008 моль) триэтиламина,: после чего реакционную смесь перемеивают при комнатной температуре до олного растворения L-пролина. Раствор выдерживают JB течение 4-5 ч и непосредственно после этого упари- на, водяной бане при температуре максимум и давлении 15- ;; 20 мбар. Полученный остаток растворяют в 25 мл воды и 10 мл дизтилово- го эфира, водную фазу два раза промывают диэтиловым эфиром 5 применяя 25 каждый раз по .10 мл последнего, а- объединённые эфирные-растворы два раза промывают 5%-ным раствором кислого углекислого натрия, причем каждый раз применяют по 10 мл этого раствора. Объединенные водные фазы подкисляют до рН 2 посредством при- , бавления 3 н. раствора соляной кислоты. Выделившийся в осадок продукт три раза экстрагируют бензолом, применяя каждый раз по 15.мл последне- го, объединенные бензольные экстракты трижды промывают водой, которую всякий раз берут в количестве 5 мл, сушат над безводным сернокислым натрием и затем упаривают на водяной бане при и давлении 15-20 мбар.

Выход 2,2 г (64%) маслообразного продукта. RP 0,5-0,6.

П р и м е р 3. Сульфат N-изобу- тил-В-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-арги- нинальдегида.

Стадия 1, N-Бензилоксикарбонил- -Н-изобутил-В-фенилапанин-Ъ-пролил- -N -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин- . лактам. 2,26 г (0,005 моль) N-бензилок-; сикарбонил-К-изобутил-р-фенилала- нин-Ь-пролина и N -трет-бутил-окси- карбонил-N -бензилоксикарбонил-L-ap- гинин-лактама (пример 1, стадия Е) 55 вводят во взаимодействие или в реакцию конденсации аналогично примеру 1, при применении пропорциональных ко30

35

40

45

50

0

5

5

0

5

0

5

0

лич еств реагентов и растворителей. . При обработке реакционной смеси и в процессе хроматографии на колонке- фракции исследуют с помощью хроматографии в тонком слое в смеси растворителей, состоящей из ЭТИЛ.ОВОГО эфира уксусной кислоты, пиридина, уксусной кислоты и воды 480:20:6:11, и фракции, которые содержат чистый продукт с R p 0,75-0,85, объединяют. Затем эти фракции упаривают на водяной бане при 40°С и при давлении 15-20 мбар, полученный остаток . обрабатывают петролейным эфиром, отфильтровывают, .продукт промывают петролейным эфиром и сушат в вакуум- эксикаторе нал парафиновыми стружками.-.

Выход 2,7 г (75%). RP 0,75-0,85, J 5,8 (с , тетрагидро- фуран).

Вычислено, %: С 66,30; Н 6,95-; N 10,87.

C4oH4gO,N,-2/3 (C4HgO) (772,90)

Найдено, %: С 65,0; Н 6,8; N 10,80.

Стадия 2. N-бензилоксикарбонил- -N-изоб утил-D-фенилаланин-L-пролил- -N -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин- альдегйд,

1,45 г (0,002 моль) N-бензилокси-, карбонил-Ы- изобутил-В- фенилаланин -L-nponkn-N -бензилоксикарбонил-Ь аргинйн лактама ; (пример 3, стадия 1) ;восстанавливают аналогично примеру 1, стадия 2, при применении пропорциональных количеств реагентов и растворителей.

Выход 1,0 г (62%). RP 0,24. С.) +2,3° (с .Г, тетрагидрофуран) .

Вычислено, %: С 66,64; Н 7,14; N11,24.

C4flHj 0, () (747,89).

Найдено, %: С 66,3; Н 7,1; N 11,2.

Стадия 3. Сульфат N-изoбyтил-D- фенилаланин Ь-пролил-Ь аргининаль- ; - дегида.

0,81 г (0,001 моль) N-бензилоксиг карбонил-Ы изобутил-В фенилаланин- -Ъ-пролил-к -бензилоксикарбонил-Ь- аргининальдегида (пример 3, стадия 2) вводят во взаимодействие ана- логично примеру 1, стадия 3, при применении пропорциональных количеств реагентов и растворителей.

Выход 0,45 г (80%), RF 1 0,64.

Вычислено, %: С 45,.84; Н 7,69; N 13,36; S 5,1.

Сз,НзвО,Ы, HjS04 4 СН,0) (628,74)

Найдено, %: С 45,8; Н 7,2; N 13,4; S 4,9.

Исходное соединение, а именно К-бензилоксикарбонил-К-изобутил-В- -фенилаланин Ь-пролин, может быть получено следующим образом.

Стадия А. N-Изобутил-D-фенилала нин.

В качестве исходного вещества применяют 8,25 г (0,05 моль) D-фе- нилаланина и осуществляют способ аналогично примеру 2, стадия А, с тем отличием, что вместо уксусного альдегида применяют 9,1 мл (0,1 мол изомасляного альдегида.

Выход 8,7 г (70%), -29,9° (с 1, 0,1 Н. раствор гидроокиси натрия).

Вычислено, N 6,08.

%: С 67,79; Н 8,75;

;,jH;,

N

1/2 () (230,30) %: С 67,2; Н 8,9;

Найдено, 6,15.

Стадия В, Ы-Бензилоксикарбонил- . -N-и.зoбyтил-D-фeнилaлaнин.

3,32 г (0,015 моль) N-изобутил- П-фенилаланина (пример 3, стадия А) вводят во взаимодействие аналогично примеру 2, стадия В.

Выход 3,2 г (60%) маслообразного продукта. RP 0,6-0,7. .

Стадия С. N-Бензилоксикарбонил- -Ы-изобутил-В-фенилаланин-Ь пролин.

2,85 г (0,008 моль) N-бензилокси- кapбDншlN-изoбyтил-D-фeнилaлaнинa (пример 3, стадия В) вводят во взаимодействие аналогично примеру 2, стадия С-.

Выход 2,45 г (67%) маслообразно- то продукта, RP 0,65-0,70.

Проводят биологические испытания производных пептидил-аргининальдеги- дов, полученных в условиях предлагаемого способа.

При проведении специальных исследований пептиды растворяют в воде (рН 6,0) в концентрациях 10 мг/см, после чего растворы хранят при 40°С В течение 5 дн. наблюдают за изменением антитромбиновой активности растворенного вещества. Характеризующее активность значение определяют в системе, которая состояла из

следующих составных частей, см

3.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

0,5%-ный фибриноген крупного рогатого скота в 0,9%-ном растворе поваренной соли 0,2; буферный раствор, содержащий трис-(оксиметил)-аминоме- тан и хлористый водород (значение рН 7,2), который также содержит раствор исследуемого пептида, 0,3; 5 ед./см раствора US Standard Human Thrombin (NIH, Бетезда, Мэриленд, CIUA) ,0,1.

Время свертывания этой системы без добавки пептида составляло в приборе Schnither Gross Coagulomefer 15 с.

Начальную- тормозящую свертывание крови активность отдельных сульфатов трипептид-альдегидов обозначают такой молярной концентрацией, которая в сравнений с контрольным опытом вызывает пятикратное удлинение . времени свертывания (1 д-значение) .

Измеренные на первые, третьи и пятые сутки антитромбиновой активности отдельных пептидов в водном растворе при рН 6,0 и -40°С от начальной активности (нулевые сутки) и приведены в табл. 1.

В течение периода наблюдения начальная активность сульфата D-фенил- аланин-Ь-пролилг-Ь-аргининальдегида уменьщается в два раза, в то время как N-метильное производное сохраняет свою первоначальную активность, а активность N-этильного и N-изобу- тильного соединений уменьшается лишь

на 15-20%. В условиях проведения 1

опытов следует считаться с частичной рецемизацией находящегося на конце молекулы L-аргининальдегида. Именно этим может быть объяснено незначительное падение активности N-этильного или N-изобутильного про- изводного.

Действие N-алкилтрипептидапьдеги- дов на плазминфибриновую реакцию также исследуют и определяют на примере сульфата Ы-метил-В-фенилала- нин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида в следующей системе, 0,05%-ный фибриноген крупного рогатого скота в 0, растворе поваренной соли ,0,2; содержащего трис-(оксиметил)- аминометан и хлористый водород буферного раствора (значение рН 7,2) ко- :торый также содержит исследуемый пептид 0,1; раствор US Standard Human Thrombin (NIH) Бетезда, Мэриленд, США/ 10 ед./см 0,1; 0,1 ед.

плазмина в 0,1 мл буферного раствора (KABI, Стокгольм, Швеция).

Время свертывания образовавшегося в системе фибринозного геля без добавления пептида 10 мин,

В качестве контрольного соединения применяют сульфат D-фенилала- нин-Ь-пролил-Ъ-аргининальдегида, а также гемисульфат трет-бутилокси- . карбонил-В-фенилаланин-Ь-пролил-Ь- -аргининапьдегида.

Действие трипептидальдегидов на плазминфибриновую реакцию показано в табл. 2 (время растворения фибринозных сгустков без добавления пептида 10 мин). ..

Из приведенных в табл. 2 данных видно, что N-алкилированный трипеп- тидальдегид ведет себя как известный, содержащий свободную расположенную на конце аминогруппу. При малых количествах образовавшиеся сгустки растворяются в течение контрольного времени, при больших количествах сгустки либо вообще не образуются, либо образуются со слабой гелевой структурой. Одновременно гемисульфат ацилтрипептидапьдегида в зависимости от концентрации удлиняет время гидролиза плазмина фибринозных сгустков.

Из описанных исследований следует, что новые трипептидальдегиды с апкилирова нными концевыми амйногруп пами обладают.значительно большей стабильностью, чем известный сульфат С-феншталанин-Ь-пролил-Ь-арги- нинальдегида, но одновременно они представляют собой аналогичные селективные замедлители свертывания, поскольку они не оказывают влияния на плазминфибриновую реакцию.

Новые N-алкилтрипептидальдегиды предлагаемой формулы обладают in vivo значительной тормозящей свертывание крови активностью. При проведении исследований пептиды вводят внутрь через рот или внутривенно новозеландским зайцам (вес 2-3 кг), причем пептиды вводят в физиологическом растворе соли. При внутривенном введении, в течение 3 ч вливания с дозами 0,5-2,0 мг/кг/ч введения производят со скоростью 6 мл/ Через рот вводят внутрь 20-30 мг/кг пептида, растворенного в объеме ,2 мл. После введения с интервалами в 30 мин из каудальной вены отбира

ют пробы крови, после чего в тромбо- эластографе определяют время свертывания всей крови, одновременно также измеряют время плазма-тромбиновой реакции.

Тормозящее свертывание в живом организме действие. N-алкилтрипептидальдегидов в опытах на самцах новозеландского зайца показано в табл. 3. Приведенные в- табл. 3 данные показывают, что N-алкилтрипептидальдегиды обладают равной или близкой активностью по сравнению с веществом, примененным для сравнения.

На основании исследований по внутривенному вливанию, осуществленных на зайцах, установлена доза для человека при внутривенном введении, составляющая 1-2 мг/кг/ч.

Проведенные испытания показывают, что N-алкильные (С .,-04)-производные сульфатов пептидилальдеги- дов в течение периода наблюдения незначительно теряют свою первоначальную активность (N-зтильные и N-изо- бутильные производные теряют активность на 15-20%), в то время как соединение сравнения дезактивируется за этот период на 60%.

. Кроме того, новые трипептидальде- гиды с алкилированными концевыми аминогруппами более стабильны, чем известный сульфат В-фенилаланин-Ь- пролил-L-аргининальдегида, но одновременно они представляют собой аналогичные селективные замедлители свертывания, поскольку при эффективном торможении тромбин-фибриногено- вой реакции они не оказывают влияния на плазминфибриновую реакцию.

Формула изобретения

Способ получения сульфатов пеп- тидил-аргининальдегидов общей формулы

5

0

R

1

В

DPhe-ppo-A-H-HoSO,

2

где

R. R водород;

С,-С4 алкил, причем R., и R

присоединены к аминогруппе

D-фенилаланина; А - остаток L-аргинина, отличающийся тем, что аргинин-лактам с защищенной гуаниди- новой группой конденсируют с защищенным по концевой аминогруппе ди- пептидом К-моноалкил()-Ь-проли- ном, полученный защищенный трипеп- тидлактам восстанавливают до соответствующего трипептидальдегида и после отщепления защитной группы целевые продукты выделяют в виде соли.

Изобретение касается производных пептидов, в частности получения сульфатов пептидил-аргининальде- гида (СП). Цель - создание новых активных веществ пептидной природы с селективным торможением свертывания крови. Синтез СП общей ф-лы: ,,- -DPhe-Pro-A-H H,S04, где R, - Н; Rj - С,4 алкил; R и R присоединены к NH Tpynne D-фенилаланина; А - остаток L-аргинина, ведут конденсацией аргинин-лактама с защищенной гуанидиновой группой и защищенного по концевой аминогруппе дипептида N-моноалкил (С)-Ь-пролина. Полученный трипептидлактам восстанавливают до альдегида и после отщепления защитных групп вьщеляют целевой продукт в виде сульфатной соли. Выход, %: брутто-ф-ла: а) 75; 0,39-0,47; (-131)°; С х7/8 () 2,5(Н20); б) 70; 0,4- 0,5; нет; 5/6 (Н jSO ) х 3,5(Н20); в). 80; 0,64; нет; C2,H380,N,-H S04-4(); д) 67; 0,85- 0,7; нет. Новые СП проявляют анти- тромбиновую активность (в сравнении с контролем в пять раз увеличивается время свертывания), оказывают влияние на плазминфибриновую реакцию, стабильны во времени, а их минимально активная доза 1-2 мг/кг. 3 табл. § САЭ 00 и 1чЭ

Сульфат N мeтил-D- -фенилаланин-Ъ-про лил-Ь-аргининальдегида

Сульфат Ы-этил-В- -фенилаланин-Ь-пролил -L-аргининальдегида 0,21

Сульфат N-изобутил- -В-фенилаланин-Ь- -пролил-Ъ аргинин- альдегида

Сульфат D-фенилала- нин-Ь-пролил-Ь-арги- нинальдегида (вещество для сравнения) 0,35

Концентрация пептида в реакционной смеси ((UM) j которая в сравнении с контрольным опытом вызывает пятикратное удлинение времени свертывания.

Таблиц

0,25 100

100

100

100

100

100

100

85

0,31

100 100

85

80

100

100

50

40

Таблица 2

2,l-)

:I

Сульфат D-фенилаланин-

-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида

Гемисульфат трет-бутил оксикарбонил-В-фенилаланин-Ъ-пролил-Ь-аргинин-

альдегида

Время растворения нельзя слабую структуру

г

Т

Трипептидальдегид

Сульфат N-метил-D-фенилаланин-Ь-пролил-Ъ-аргининальдегида

Сульфат К-этил

-D-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-арги

нинальдегида

Сульфат N-изобутил-В-фенилаланин-Ъ-пролил-Ь-аргининальдегида

Сульфат D-фенилала- нин-Ь-пролил-Ь-арги нйнальдегида (вещество для сравнения)