Циклический октапептид,обладающий гипотензивной активностью и устройство к действию карбоксипептидаз Советский патент 1986 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

1 зобретение относится к новому .биологически активному соединению циклическому октапептиду формулы 1 .Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ige-Leui обладающему гипотензивной активно- . стью и устойчивостью к действию карбоксипептидаз, которое может найти применение в медицине. Известен природньй трвдекапептиднейротензин формулы p-Glu-Leu-Tyr-Glu-Asu-Lys-Pro-Avg-Avg-Pro-Tyt-1 Ге-Leu, обладающий гипотензивным действием. Известно, что фрагмент нейротензина последовательности 8-13: Arg-Arg-Pro-Tyr-IJe-Leu, обладает полным спектром биологического дейс вия нейротензина и, в частности, гипотензивным действием. Недостатком нейротензина и его уко роченного аналога является их быстр расщепление в организме под действи карбоксипептидаз, что определяет кратковременность их действия. Наиболее близким по химической структуре к описываемому октапептиду является циклический гексапептид формулы U Lys-Arg-Pro-Tyr-Ife-Leu т обладающий гипотензивным действием и устойчивостью к действию карбокси пептидаз 4. Недостатком его в сравнении с нейротеи ином; является невысокая гипотензивная активность. Цель изйбретения - новый аналог .нейротензина, обладающий более высок -гипотензивной активностью и устойчивостью к действию ферментов. Поставленная цель достигается ци лическим октапептидом формулы J. . Синтез циклического октапептида форму.пы I осотествляют твердофазным методом путем ступенчатого наращива НИН пептидной цепи, начиная с С-кон ценой аминокислоты, ковалентно связанной с полимерным носителем, с использованием дициклогексилкарбоди имида в качестве конденсирующего агента, с последующим отщеплением защищенного линейного октапептида 20. 2 от полимерного носителя, циклизацией и удалением защитных группа Для защиты cL -аминогруппы аминокислоты используют трет-бутилбксикарбонильную группу, за исключением N-концевого лизина, где используют бензилоксикарбонильную группу. Для защиты боковых функциональных групп тирозина, аргинина и лизина используют соответственно бензильную, нитро- и трет-бутилоксикарбонильную группы. Все аминокислоты имеют L-конфигурацию. Твердофазный синтез защищенного октапептида:осуществляют с помощью автоматического синтезатора Beckman990 В (США). В качествеполимерного носителя используют хлорметилированный полимер Bio Bends с 1%-ным содержанием дивинилбензола и емкостью 4,2 ьмоль/г. Гомогенность полученных соединений контролирзпот с помощью тонкослойной хроматографии и электрофореза. Тонкослойную хроматографию осуществляют на пластинках с силикагелем фирмы; Мерк (ФРГ) в следуняцих системах:А. Хлороформ - метанол - уксусная кислота (9:1:0,5); Б. Пиридин уксусная кислота вода - этилацетат (20:6:11 г :3,25)} Хлороформ - метанол - уксусная кислота - вода (60:18:2:3); Хлороформ - метанол - уксусная кислота - вода (30:20:4:6); Этилацетат - уксусная кислота н-бутанол - вода (2:1:1:1); н-Бутанол - пиридин - уксусная кислота - вода (15:10:3:12). Электрофорез проводят на бумаге FN-17 -(ГДР) в 1 н. уксусной кислоте (рН 2,1) nprf напряжении 30 в/см. Электрофоретическая подвижность соединений приведена по отнощению к гис;г тидину (Е fyg ). Вещества на хроматограммах и электрофореграммах детектируют с помощью реактива Сакагуси, Паули, а также нингидриновым и бензидиновым реактивами. Удельные углы оптического вращения измеряют на поляргадетре Parkin .Elmer-142 (США). Аминокислотный состав определяют на анализаторе Liguimat Ш (ФРГ) после кислотного гидролиза пептидов в течейие 24 ч при 110С в 6 н.соляной кислоте, содержащей 1% фенола. Массспектр циклоаналога снимали на приборе Varian MAT CH-5DF и приставкой EI-FI-FD. Пример. Получение циклическ го октапептида формулы I . Ы -бензилоксикарбонш1-Н -трет-бyтилoкcикapбoнил-лизшI-пpoлил-N -нитроаргинил-N -нитроаргинил-проли -пролил-о-бензил-тироэил-иэолейцил- лейцин () Z-Lys (Вое) -Pro-Arg (NOj.) -Arg (NO г.) -Pro-Туг(Bzl)-IEe-LeuOH. Исходный Boc-Leu-полимер получаю исходя из 5 г полимера и 7 г Boc-Le Начальная емкость аминоацилполимера определенная по привесу и данным аминокислотного анализа, составляет 5,0 1умоль/г полимера. Твердофазный синтез линейного защищенного октапептидилполимера проводят по програм мам i и 2, приведенным в табл. 1 и Защищенные аминокислоты присоединяю к пептидил полимеру карбодиимидным методов по программе 1 д После завершения реакции на каждо стадии синтеза выполнялась программа 2 - повторение реакции конденсации и ацетилирование непрореагировав ших аминогрупп уксусным ангидридом. Н трет-бутилоксикарбониламинокислоты перед загрузкой в реактор синтезатора растворяют в хлористом метилене, N -трет-бутилоксикарбонил-N -нитроаргинил растворяют в хлористом метилене. Содержащем 10% диметилформамвда. В итоге после отщепления полимерного носителя методом щелочного омыления получают 6,7 г (4,2 ммоль) сырого продукта, который очищают на препаративной колонке с силикагелем ,фирмы Мерк (ФРГ) с использованием в качестве элюента системы А. В итог получают 2,9 г (46%)защищенного линейного октапептида Ш , гомогенного по данным ТСХ: RI 0,45 (А), 0,33 (Б), 0,86 (Д). оС 2. Пентафторфениловый эфир N -бензилоксикарбонил-N -трет-бутилоксикарбонш1-лизил-пролил-Ы -нитроаргинил-N -нитроаргинил-пролил-о- -бензилг-тирозил-изолейцин-лецина (1У Z-Lys (Boc)-Pro-Arg(NO)-Arg(N02)-Pro Tyr(Bzl)-IPe-Leu-OPfp 1 г (0,62 fмoль) Ш растворяют в 10 мл хлороформа и 10 мл диоксана, при 0°С добавляют 590 мг (0,55 мМ) комплекса F, представляющего ссзбой комплекс пентафторфенола и N,N -дициклогексилкарбодиимида (3:1) и оставляют на 12 ч при О С. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают, остаток растирают с эфи; ром. В итоге получают 1,0 г (91%)У , R 0,59 (Б). Ш. Хлоргидрат пентафторфенилового эфира М -бензилбксикарбонил-лизил-пpoлшI-N -нитроаргинил-N -нитроаргинил-пролил-о-бензилтирозил-изолейцил-лейцина (1). 4,0 г (0,57 ммоль) ly растворяют в 5 мл уксусной кислоты, добавляют 30 мл насыщенного раствора хлористого водорода в уксусной кислоте,через 30 миндобавляют сухой эфир, выпавщий продукт отфильтровывают.. В итоге получают 0,800 г (84%)1 , R ,04 (Б). ly . Цикло-(Н -бензилоксикарбонил-лизил-пролш1-М -нитроаргинил-N -нитроаргинил-пролш1-о-бензш1-тирозил-изолейцил-лейцил) (W ). 0,8 г (0,46 ммоль)у растворяют в смеси, состоящей из 40 мл диметилформамида и 800 мг перегнанного диоксана. При 20 С по каплям при перемешивании добавляют 0,2 г (1,5 ммоль) диизопропилзтиламина. Реакционную смесь перемешивают 64 ч, затем упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 10 мл смеси этнлацетатэтанол (10:1), осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают и остаток растирают с эфиром. Полученны(1 сырой продукт очищают хроматографически на препаративной колонке с силикагелем фирмы Мерк с использованием в качестве элюента системы. В итоге получают 220 мг (30%) vi , R|.0,62 (Б), 0,56 (В). J. Цикло-(лизил-пролил-аргинилпролнл-тирозил-изолейцил-лейцил) (1) |-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro- Tyr-If e-Leu 220 мг (0,15 ммоль)yi растворяют 25 мл смеси метанол - уксусная кисота - вода (10:1:1), добавляют паладиевую чернь и гидрируют 20 ч. атем катализатор отфильтровьгоают, . фильтрат упаривают, добавляют эфир и выпавший продукт отфильтровьгоают. Получаадт 130,г (74%) Л . Выделенный свободный пептид очгацают хроматографически на носителе типа обратная фаза Zorbax Cg, с использованием в качестве элюента смеси, состоящей из 30% этанола и 70% 0,25М водного раст вора ацетата аймонйй. Досле упаривария растворителя остаток лиофилизуют из воды. В итоге получают .27 мг (27%) I , Rf 0,38 (Г) 0,12 (Д), , (Е); Е s 0,86, ы.-67,5 (С 0,2% метанол). Аминокислотный анализа: Pro 1,90 (Z); зее. 1,0«| (I); Leu 0,94 (i); Туг 0,88 (I); Lys 1,0 (Т); Arg 2,24 (Г) мол.вес 1023. Выход 1 рассчитьгоая на первую аминокислоту 8,7% Исследована биологическая активность описываемого дикйооктапептида; . в опытах invivon invitro. В качестве стандартного соединения использовали синтетический нейротензин фирмы Sigma (США). Для сравнения биологического действия использовали такж циклический гексапептид М . В опытах in vivo изучена гипотензивная активность - влияние циклооктапептида 1 на артериальное давление наркотизированных этаминал-натрием крыс обоего пола массой 200-220 г, имеющих начальное артериальное давление ,120-140 мм рт.ст. Исследуемые вещес,тва вводят в дозах 0,12525 в бедренную вену. Артериальное давление регистрируют из общей сонной артерии при помощи ртут ного манометра. Полученные результат представлены в табл. 3. Миотропное действие циклического октапептвда Т изучают в опытах in vitro на изолированной подвздошной морских свинок обоего пола мдссой 350-400 г. 20ft Эксперименты проводят в изотоническом режиме по методу регистрации кумулятивньЬс кривых концентрация эффект с вычислением параметров: внутренняя активность об и сродство к рецептору pD2 (см. табл. 4). Острую токсичность i определяют на белых безлинейных мьш1ах при внутривенном введении. При исследовании влияния описываемого соединения (I) на артериальное давление наркотизированных крыс показано, что соединение I в условиях опыта обладает значительным депрессорным действием. Эквидепрессорный эффект аналога достигается при дозах, в среднем, в два раза превышакщих дозы нейротензина, за исключением дозы 5 нм/кг, которая вызьшает одинаковый эффект у нейротензина и описываемого соединения J (см. табл. 3). Сравнения с ближайшим структурным аналогом гексапептидом 1L показьгоает, что Эквидепрессорный эффект аналога достигается в дозах в- 10 раз превосходящих дозы описываемого циклооктапептида.. В опытах in vitro установлено, что опиа 1ваемый циклооктапептид обладает более йизкой миотропной активностью,чем нейротензин. Сродство к рецёптоду гладкой мускулатуры ниже примерно на два порядка при значительно сниженной внутренней активности (см. табл. 4), т.е. описываемый циклический октапептвд обладает большей избирательностью действия. ТЩдаДЛЯ описываемого соединения составляет 9 мг/кг, т.е. летальная доза более чем в 18000 раз превышает дозу, при которой наблюдается явный депрессорный эффект (0,3 мкг/кг). Циклический октапептид X устойчив к действию карбоксипептидазы В в среде О,2 М буферного раствора ацетата Н-метилморфолина при рН 8,5 и 37 С.

Программа 1 твердофазного синтеза на 10 г полимера (отщепление защитной группы и конденсация)

Таблица 1

Циклический октапептид формулы fLys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ifc-LeuT, обладающий гипотензивной активностью и устойчивостью к действию карбоксипептидаз.

8Добавление Вос-аминокислоты0,5М BQC-a.K.

9Добавление

10 Реакция конденсации

11 Промывка

Переход к 1-ой строке программы 2

1М DCC/CHj Cl

10

60

40 X 5 1,5

91114020

. Программа твердофазного синтеза № 2 (повторная конденсация и ацетилирование)

1 Промывка

2 То же

, 3 Нейтрализация

4 Промывка

5 Добавление Вое/аминокислоты0,5М Вос-а.к.. 20

Переход к 1-он строке программы 1

10 Таблица 2

40

40

1,5

40 X 8 1,5 25% Etj, 40x2 1,5