Способ определения фертильности пыльцы цветковых растений Советский патент 1982 года по МПК A01H1/02 A01G7/00 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРТИЛЬНОСТИ ПЫЛЬЦЫ ЦВЕТКОВЫХ РАСТЕНИЙ

Изобретение относится к селекции к семеноводству и может быть использован в сельском хозяйстве. Известны способы определения фертиль ности, предусматривающие проращивание. пыльцы в камере Ван-Тигена с использованием искусственной среды или использование способа B.C. Шардакова путем воздействия бензидила на живую пыльцу, содержащую пероксидазу 1 . Однако известные определения фертипь ности пыльцы не позволяют проводить анализ в полевых условиях из-за необходимости использования специального оборудования, а также требуют Значительных затрат времени, что отрицательно сказывается на качестве пыльцы и искажает получаемые результаты. Известен также способ определения жиз неспособности и фертильности пыльцы П. И. Диако, заключающийся в том, что о жизнеспособности пыльцы судят по наличию активного дыхательного фермента сукциндегидразы, в присутствии которого бесцветный раствор 2, 3, 5 - трифенилтетразол хлористый в 1/15 М фосфатном буфере Серенсена с рН 7,17 восстанавливается в формазан ярко-красного цвета. Погибшие пыльцевые клетки остаются бесцветными 2 . Недостатком известного способа является то, что степень окраски пыльцевых зерен в красный цвет осуществляется визуально, что не позволяет различить категории полустерильных и полуфертильных пыльцевых зерен, Kpravte того, дыхательный фермент сукциндегидраза, дающий ярко-красное окрашивание, выделяется из пыльцевого зерна в окружающую среду, что дает ярко-красное окрашивание этого раствора, маскирующего истинный цвет пыльцевых зерен. Цель изобретения - получение более точных результатов за счет быстрой и длительно сохраняемой фиксации. Поставленная цель достигается тем, что в смесь 0,5-1,0 о-ного раствора 2, 3, 5-три()енУШтетразопа хлористого и 1/15 М фосс)атного буфета CepeHcevja рН 7,17 ввоцят 1,,3%-ный раствор йод-калий-йод, полученную массу микроскотфуют и по окраске пыльцы судят об ее фертипьности. 1 3/& ный раствор йод-калий-йод гот вят из расчета 1-3 г металлического йода в растворе 2 г калий-йод и 297 г дистилшфовавной воды (по Грамму). К фертийькым пальцевым зернам относят зерна черно-фиолетовой окраски, к полу- фертильным - зерна, одна клетка которых черно-фиолетовой окраски, а другая розово-оранжевой, к полустерильным - зерна с серо-фиолетовой окраской и к стериальиым - зерна белые или яркожелтые. Собранную в поле пыльцу наносят тон кой кисточкой на предметное стекло и распределяют тонким слоем на плошади в 1 см, капают на пыльцу 1 каплю О,5 1,0%-иого раствора 2, 3, 5-трифенилтет разола хлористого в 1/15 М фосфатном буфере Серенсена, рН 7,17, тщательно смешивают ао получе гая однородной массы, которая сразу розовеет от выаеля огцегося фермента сукциндегидразы. Затем слегка смоченной в 1,,0%-ном раствор йод-калий-йода стеклянной палочкой еще р тщательно перемешивают массу пыльцы, ко торая в результате гфио.бретае.т темную ок раску и хорошо различима в розовой жидкост Для микроскоп1фования с помощью мик- роскопа А1БС-«1 или в поле или в noMsmeHvra полученную смесь пыльцы и реактивов покрывают покров ЕЫМ стеклом с нанесенной заранее сеткой. Размер сет ки 10x10 K-iM, причем, при подсчете фер- тильных и стерильных пылинок просматривают 5 вертикальных рядов сетки, считая через ряд (10 ячеек х рядов 50 ячеек-квадратов). Под влиянием использования в реакции двух перечисленных реактивов nbintfцевые зерна и окружающий раствор сначала становятся розовыми, затем оранже выми, потом фертильные зерна приобретают черно-фиолетовый цвет (от взаимо действия йода и крахмала), а светлая половина фертипьных пыльцевых зерен становится оранжевой или абрикосоворозовой. Весь процесс анализа пыльцы от МО мента ее взятия до окончания микроскопиро&ания aauviMaeT 5-10 мин. При необходимости вьтвоза пыльпы с поля для анапиза в лаборатории м.анный способ обеспечивает фиксирование за счет йод-калий-йода истинного количества фертильных пыльцевых зерен. Окраска, вызва-нная последовательным действием реактивов, обеспечивает устойчивый цвет, сохраняющийся на протяжении не менее шести месяцев без изменения. При длительном хранении окрашенной пыпьцы, ее следует поместить на предметное стекло с выемкой дпя висячей капли, обработать реактивами согпасно данному способу, покрыть покровным стеклом и хранить в высохшем состоянии. Приступая к подсчету процента фертипьных пыльцевых зерен, необходимо добавить к пыльце одну каплю дистиллированной или кипяченой воды. Подсчет производит- ся на покрывном стекле по указанной методике. Пример. Обработку производят следующим образом: пыльцу кукурузы -геHOTvinoB NVF -9 и Д-765 наносят тонким слоем на предметное стекло кисточкой на площади 0.5 см. Затем капельницей наносят одну каплю 0,5%-ного раствора 2, 3, 5-трифенилтетразола хлористого в 1/15 М фосфатнсФД буфере Серенсена, рН 7,17 и препаровальной иглой тщательно смешивают с пыльцой. В течение 3 мин проходит реакция в данной смеси, и под влиянием дыхательного фермента пыльцы ее живые клетки и окружающий раствор окрасились в розовый цвет одной интенсивности. Затем стеклянную палочку окунают в 1,0%-ный раствор йод-калиййода, стряхивают каплю в сторону и мок рую палочку вводят в смесь пыльцы и описанного раствора, тщательно перемещав смесь. В результате раствор в смеси приобретает абрикосово-оранжевый цвет, а пыльцевые зерна потемнеют, что видно невооруженным глазом. Под стереоскопическим микроскопом МБС-2 видно, что жидкость в кагте смеси имеет абрикосово-оранжевую окраску, а пыльцевые зерна, отреагировав с йодом, получают разную окраску в зависимости от степени фертильности, а именно: фертильные зерна становятся черно-фиолетовыми, по- луфертильные имеют половину (одну клет ку пыльцевого зерна) черно-фиолетовую, а вторую половину ( вторую клетку пыль-i левого зерна) розово-оранжевую, полусте рильные пыльцевые зерна равномерно или однобоко серо-фиолетовые или серо-коричневатые, стерильные - белые или ярко