СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БОТАНИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЁДА Российский патент 2020 года по МПК G01N33/02 G01N21/00 G01N1/28 

Изобретение относится к пищевой промышленности, пчеловодству, а именно к способам установления ботанического происхождения меда для подтверждения его натуральности. Проблема фальсификации меда в настоящее время является актуальной для всех потребителей. Применение фальсификата в лучшем случае не окажет никакого положительного влияния на здоровье человека, а в худшем - может ему навредить.

Известен органолептический способ оценки качества меда (по профилям: вкус, аромат, цвет), который не гарантирует достоверность натуральности происхождения меда, так как является, во-первых, субъективным (сколько людей столько и мнений). Кроме того, на сегодняшний день используют массу ароматических веществ высокого качества для фальсификации меда.

Существуют способы определения ботанического происхождения медов, основанные на известном факте, что в нектарах собранных с цветков растений медоносными пчелами присутствуют пыльцевые зерна [1]

Предложен способ определения ботанического происхождения меда с помощью анализа ДНК (заявка RU 2015148090 от 09.11.2015) [2]. Для выделения ДНК используется специальный лизирующий буфер, содержащий детергент цетилтриметиламмония бромид, антиоксидантдитиотреитол, связывающий фенольные соединения поливинилтирролидон, высокую концентрацию хлорида натрия, комплексообразователь N, N, N¹, N¹ -этилендиаминтетраусусную кислоту, буферную соль трис-гидрохлорид, процесс разрушения (лизиса) совмещается с ультразвуковой обработкой препарата, а непосредственное определение индивидуального медоноса-источника нектара при сборе меда осуществляется с помощью полимеразной цепной реакции методом гель-электрофореза.

Недостатками данного способа является использование дорогостоящих реактивов, его трудоемкость для установления всех индивидуальных медоносов - источников нектара.

Известен ГОСТ 31769-2012 [3], в котором предложен метод определения частоты встречаемости пыльцевых зерен. Он предусматривает использование 10 г меда растворенного в 20 мл дистиллированной воды, при температуре 40°С, центрифугирование раствора в течение 10 мин при ускорении 1000g, слив надосадочной жидкости добавление к осадку 20 мл дистиллированной воды, повторное центрифугирование в течение 5 мин при ускорении 1000g. Затем надосадочную жидкость декантируют, центрифужную пробирку помещают на фильтровальную бумагу под углом 45° для удаления остатков жидкости, осадок перемешивают микробиологической петлей и переносят на предварительно прогретое 40°С предметное стекло и равномерно распределяют по площади 22×22 мм микрошпателем. Каплю глицеринового желатина, разогретого до 40°С, распределяют крестообразно (по диагонали) на покровном стекле и медленно опускают на высушенный осадок, который для оптимального набухания пыльцы добавочно подогревают в течение 5 мин при 40°С. Микроскопирование препарата проводят после застывания глицеринового желатина. Вычисляют среднеарифметическое значение каждого выявленного морфологического типа пыльцы, сумму среднеарифметических значений и частоту их встречаемости.

Недостатками данного способа в результате центрифугирования раствора меда происходит деформирование пыльцевых зерен, что в значительной мере затрудняет их последующую идентификацию, а также образование сгустков слипшихся зерен пыльцы, которые невозможно разъединить и равномерно распределить по предметному стеклу петлей. (Фиг. 1, 2).

Наиболее близкой к предлагаемому способу является методика определения пыльцы в меде [4], принятая нами в качестве прототипа. Исследуемую пробу 9 не менее 200 г) отбирают по ГОСТ 31766-20-12, ГОСТ 19792-2001. Закристаллизовавшийся мед декристаллизуют на водяной бане. Сотовый незакристаллизовавшийся мед отделяют от сотов фильтрацией без нагрева. Сотовый закристаллизовавшийся мед декристаллизуют в термостате, затем отделяют от сотов фильтрацией. Пробу тщательно перемешивают. В мерную колбу объемом 150 мл наливают 100 мл пробы меда, нагретой до температуры 50…60°С.

Суть методики заключается в том, что из пробы микропипеткой берут каплю меда, объем которой составляет около 100 мкл) и готовят препарат для световой микроскопии. Пыльцевые зерна идентифицируют, затем высчитывают количественное и процентное отношение отдельных их видов из числа учтенных. Дозаторной пипеткой отбирают 100 мкл меда из мерной колбы (глубина 40 мл), переносят его на предметное стекло и равномерно распределяют гранью покровного стекла по площади 18×18 мм. Далее покровное стекло медленно во избежание воздушных пузырьков опускают на мед.

Для проведения анализа используют лабораторные весы с пределом абсолютной погрешности не более 0,01 г, пипеточный одноканальный дозатор переменного объема по ТУ 9452-002-33189998-2002, световой биологический микроскоп с увеличением 100-600, фотокамеру, адаптированную к микроскопу и компьютер, конусный матерчатый фильтр, термостат и водяную баню.

Просмотр и подсчет пыльцевых зерен под микроскопом проводят при увеличении 100. идентифицируют пыльцевые зерна под микроскопом при увеличении 400 и 600. За результат испытаний принимается среднеарифметическое значение трех проб, взятых с различной глубины образца.

Недостатками рассматриваемой методики являются: невозможность обнаружения пыльцевых зерен в предложенном объеме, в частности, в акациевом и липовых медах, в которых количество пыльцевых зерен в 1 г не превышает 15 единиц, а в кипрейном - 1-2 единиц. В этом случае во взятом объеме 100 мкл (0,1 мл), их можно вообще не обнаружить, что ставит под сомнение достоверность полученных результатов; далее по методике, нанесение на предметное стекло путем физического вытеснения из капиллярной трубки объемом 100 мкл сомнительно, так как в любом случае часть меда, включая и пыльцевые зерна, останется на стенках трубки; нагревание образца меда до температуры 50-60°С неизбежно приведет к деформации пыльцевых зерен (тепловая денатурация белков) [5], что затруднит их идентификацию.

В силу вышеизложенных недостатков достоверность получаемых результатов по данной методике вызывает сомнение, и она не приемлема для определения истинного соотношения пыльцевых зерен, которое определяет ботаническое происхождение меда.

Задачей изобретения является разработка объективного, простого в исполнении и воспроизводстве способа определения ботанического происхождения меда, основанного на сохранении морфологических особенностей пыльцевых зерен и их пространственного расположения, что позволит определить истинное содержание их и одновременно значительно снизить трудоемкость исследований и материальные затраты.

Сущность метода заключается в том, что центробежный образец меда объемом не менее 200 мл свежий или разогретый на водяной бане, в случае, если мед закристаллизован, до температуры, не превышающей 30°С во избежание деформации пыльцевых зерен, размешивается и наносится стеклянной палочкой на предметное стекло в количестве одной естественной капли, которую закрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом при увеличении 400 для изучения морфологических особенностей (борозд, ор, пор, характер апертур, текстура, скульптура, замер полярной оси и экваториального диаметра пыльцевого зерна), идентифицируют для дальнейшего подсчета пыльцевых зерен. Естественная капля - это относительно небольшой объем жидкого вещества, ограниченный поверхностью, обусловленной преимущественно действием сил поверхностного натяжения. Капля образуется при медленном истечении жидкости из небольшого отверстия или стекании ее с края поверхности [7].

На следующем этапе подсчитывают количественное присутствие каждого типа пыльцевых зерен при увеличении 100 в 10 полях зрения (Фиг. 3) в 5 каплях исследуемого образца. Многократная повторность (50) позволяет статистически точно определить средневзвешенное число идентифицированных типов пыльцевых зерен с минимальной ошибкой.

Экспериментальные данные обрабатывают с использованием пакета прикладных программ Snedecor V4 [8]. За результат испытаний принимают среднеарифметическое значение результатов пяти параллельных определений (5 капель), полученных в условиях повторяемости согласно ГОСТ ISO 5724-6 [6], где ∑_(1+2+…i) - сумма среднеарифметических значений общего количества подсчитанных пыльцевых зерен каждого идентифицированного типа и вычисляют частоту встречаемости рассчитывают по формуле: К=i/∑_(1+2+…i), где i - выявленные типы пыльцевых зерен.

Ботаническое происхождение меда определяют исходя из процентного присутствия пыльцевых зерен: в случае присутствия пыльцевых зерен одного морфологического типа превышающего 45%, исследуемый образец меда считается монофлерным, от 16 до 45% -составной частью смешанного меда (полифлерный), от 0 до 16% не принимается в расчет.

Пример

Образец объемом 200 мл свежего центробежного меда тщательно перемешивается стеклянной палочкой и наносится в размере одной естественной капли на предметное стекло, закрывается покровным стеклом и далее исследуется под микроскопом при увеличении 400 морфологическое строение пыльцевых зерен.

Экспериментальные данные обработаны с использованием пакета прикладных программ Snedecor V4 [8]. Результат вычислений представляли в виде значения, округленного до сотых долей в диапазоне частоты встречаемости от 0,1 до 1,0; десятых долей от 1,0 до 10,0; целых чисел от 10,0 до 100,0.

Подсчитывается общее количество пыльцевых зерен каждого морфологического типа, встреченных в 10 счетных полях при увеличении 100, в одной капле меда:

пыльцевые зерна дягиля в первой капле 251,2±11,91, во второй капле 283,0±22,22, в третьей капле 288,5±11,02, в четвертой капле 240,8±14,01, в пятой капле 241,5±1,68;

пыльцевые зерна борщевика сибирского - 24,5±6,21, 29,3±5,21, 24,9±4,20, 28,7±4,27, 28,9±3,14 соответственно;

пыльцевые зерна купыря лесного: 16,2±0,70, 9,1±0,67, 10,7±0,70,10,1±0,89, 10,1±0,71, т.д. в соответствии с таблицей.

Затем определяется среднеарифметическое значение каждого морфологического типа пыльцы 10 счетных полей в 5 каплях меда, где среднеарифметическое значение пыльцевых зерен дягиля составило 261,0±10,31, борщевика сибирского - 27,1±1,12, купыря лесного -11,2±1,27 и т.д. (табл.). Многократная повторность (50) позволила статистически точно определить средневзвешенное число идентифицированных типов пыльцевых зерен с минимальной ошибкой.

Подсчитывается сумма среднеарифметических значений общего количества пыльцевых зерен во всех счетных полях, всех встреченных морфологических типов, которая составила 341,5 и определяется частота встречаемости, т.е. процентное соотношение пыльцевых зерен, где частота встречаемости пыльцевых зерен дягиля составила К=(261,0/341,5) ×100=76,42%, частота встречаемости пыльцевых зерен борщевика сибирского К=(27,1/341,5)×100=7,93%, частота встречаемости пыльцевых зерен купыря лесного К=(11,2/341,5)×100=3,27% и т.д. (табл.).

Ботаническое происхождение меда определили исходя из процентного присутствия пыльцевых зерен дягиля, частота встречаемости которых составила 76,42%. Результаты анализа показали, что исследуемый мед является монофлерным, собранным в основном с дягиля.

Многократная повторность (50) позволила статистически точно определить средневзвешенное число идентифицированных типов пыльцевых зерен с минимальной ошибкой.

Предлагаемый нами способ определения ботанического происхождения меда является объективным, простым в исполнении и воспроизводстве способом, основанным на сохранении морфологических особенностей пыльцевых зерен, что позволяет определить истинное содержание их и одновременно значительно снизить трудоемкость исследований и материальные затраты.

Список используемой литературы

1. Демианович, З. Вклад польских ученых в исследование в развитие пчелоботаники // Докл. XXIV Междунар. конгр. по пчеловодству. - Буэнос-Айрес (Аргентина), 1973. - С. 469-471.

2. Заявка на изобретение РФ 2015148090 Опубликовано 11.05.2015, Бюл. 14. Способ определения ботанического происхождения меда с помощью анализа ДНК

3. ГОСТ 31769-2012. Мед. Метод определения частоты встречаемости пыльцевых зерен. Москва: Стандартинформ, 2014 - 15 с. Введен 2013-07-01

4. Халько А.Н. Методика определения пыльцы в меде. Пчеловодство. 2014. №5.

5. Поттхаст К, Ферментативная реакция в пищевых продуктах с низким содержанием влаги / К Поттхаст, Р. Хамм, Л. Аккер Вода в пищевых продуктах 1980, Москва: Пищевая промышленность. - С. 222-231

6. ГОСТ ISO 5725-6. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Ч. 6. Использование значений точности на практике. Госстандарт России. 2002.

7. Многоликая планета: Вода. Бук Хаус.2005, 296 с., ISBN 5-98641-008-4

8. Сорокин, О.Д. Прикладная статистика на компьютере. - Краснообск, ГУП РПО СО РАСХН, 2004. - 162 с.

Изобретение относится к пищевой промышленности, пчеловодству, а именно к способам установления ботанического происхождения меда для подтверждения его натуральности. Способ определения ботанического происхождения меда предусматривает исследование структурных особенностей пыльцевых зерен под микроскопом при увеличении 400 взятого из образца свежего центробежного меда объемом не менее 200 мл. Способ включает подсчет количественного присутствия каждого морфологического типа пыльцевых зерен при увеличении 100, подсчет суммы среднеарифметических значений общего количества подсчитанных пыльцевых зерен каждого идентифицированного типа по формуле ∑_(1+2+…i) и вычисление частоты встречаемости по формуле K=i/∑_(1+2+…i), где i - выявленные типы пыльцевых зерен. Ботаническое происхождение меда определяется исходя из процентного присутствия пыльцевых зерен. При этом исследование морфологических особенностей пыльцевых зерен проводится в одной естественной капле меда из образца, не подвергнутого центрифугированию и тепловой обработке. Способ является объективным, простым в исполнении и воспроизводстве, позволяет определить истинное содержание пыльцевых зерен и одновременно значительно снизить трудоемкость исследований и материальные затраты. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

1. Способ определения ботанического происхождения меда, предусматривающий исследование структурных особенностей пыльцевых зерен под микроскопом при увеличении 400, взятого из образца свежего центробежного меда объемом не менее 200 мл, подсчет количественного присутствия каждого морфологического типа пыльцевых зерен при увеличении 100, подсчет суммы среднеарифметических значений общего количества подсчитанных пыльцевых зерен каждого идентифицированного типа по формуле ∑_(1+2+…i) и вычисление частоты встречаемости по формуле K=i/∑_(1+2+…i), где i - выявленные типы пыльцевых зерен, ботаническое происхождение меда определяется исходя из процентного присутствия пыльцевых зерен, отличающийся тем, что исследование морфологических особенностей пыльцевых зерен проводится в одной естественной капле меда, из образца, не подвергнутого центрифугированию и тепловой обработке.

2. Способ определения ботанического происхождения меда по п. 1, отличающийся тем, что подсчет пыльцевых зерен проводится в 10 полях зрения в 5 каплях исследуемого образца.

3. Способ определения ботанического происхождения меда по п. 1, отличающийся тем, что испытуемый закристаллизовавшийся мед нагревают до температуры, не превышающей 30°С.