Способ определения жизнеспособности клеток Советский патент 1962 года по МПК A01G1/02 

Известны способы определения жизнеспособности клеток путем помещения их в раствор трифенилтетразол хлорида, в котором живые клетки окрашиваются в красный цвет.

В отличие от известного, с целью использования этого способа для определения жизнеспособности пыльцевых зерен, которые лопаются в водном растворе, пыльцевые зерна помещают в раствор трифенилтетразол хлорида в буфере с рН 7,2 приготовленном, например, из солей NaHPO4 2Н2О и КНгРО.

На фиг. 1 изображена жизнеспособная (на чертеже черная) пыльца кукурузы; на фиг. 2 - смесь жизнеспособной и мертвой {на чертеже светлая) пыльцы.

Определение жизнеспособности клеток основано на том, что с прекращением жизнеспособности прекращается дыхание. В основе предлагаемого способа лежит выявление активности ферментов дегидразной системы в процессе дыхания живой пыльцы.

Дегидразы катализируют отнятие водорода и тем самым окисление данного вещества и осуществляют перенос водорода к другому веществу.

Для определения активности дегидраз используется реактив трифенилтетразол хлорид, который присоединяет катализируемый дегидразами водород и дает цветную реакцию, позволяющую четко отличить мертвые клетки от живых.

Красное соединение формазан (в случае живой пыльцы) образуется по следующей формуле:

N - N - CgHs , „,,. N - NH - СоН,

.

CgHg - с CgHg - с

N-N-СеН,,

№ 145398- 2 Для определения жизнеспособности пыльцы предлагаемым методом рекомендуется следующая последовательность работы:

Приготовить 0,1% раствор трифенилтетразол хлорида в 0,1 м фосфатного буфера (рН 7,2), нанести пыльцу на предметное стекло, капнуть на пыльцу фосфатный буфер (рН 7,2) и выдержать 4-5 мин. После этого буферный раствор осторожно отсосать фильтровальной бумагой. Затем нанести 1-2 капли раствора трифенилтетразол хлорида, накрыть покровным стеклом и поставить в термостат на 30 лгин. при температуре 37°.

Для определения процента жизнеспособности пыльцы под микроскопогл просматривается не менее 3-5 препаратов по 5 полей зрения в каждом. Красное окрашивание пыльцевых зерен указывает на присутствие дегидразной активности, то есть на жизнеспособность пыльцы. Мертвые зерна не окрашиваются и остаются желтыми (на чертеже светлые).

Предложенный метод дает точное представление о качестве пыльды в момент цветения исследуемых самоопыленных линий, что особенно важно и необходимо при осуществлении перехода к семеноводству гибридной кукурузы на стерильной основе.

Всесоюзный научно-исследовательский институт кукурузы ОлЮбряет предложенный способ, так как он представляет интерес для практических работ в области селекции, генетики и других смежных наук в тех случаях, когда необходимо проверить способность пыльцы к оплодотворению после определенного нериода ее хранения.

Предмет изобретения

Способ определения жизнеспособности клеток путем помешения их в раствор трифенилтетразол хлорида, в котором живые клетки окрашиваются в красный цвет, отличающийся тем, что, с целью использования этого способа для определения жизнеспособности пыльцевых зерен, которые лопаются в водном растворе, пыльцевые зерна помещают в раствор указанной соли в буфере с рН 7,2, приготовленном, например, из солей NaHPO4 2Н20 и КН2Р04.