Способ определения суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов Советский патент 1982 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к биохимии и химии и может быть использовано при биохимическом анализе фосфолипидов в крови, в органах животных, например, печени, а также в опухоли. Известен способ определения количества фосфолипидов, включающих выде ление фосфолипидов из крови, растворение их, добавление к раствору фосфолипидов водного раствора красителя оранжевого кислотного, смесь разделяют отстаиванием в делительной воронке и определение количества фосфо липидов по количеству перешедшего в органическую фазу красителя 11Недостатками этого способа являют ;ся большая трудоемкость. Раствор кра сителя вносят в мицеллу в несколько приемов, а смесь отделяют отстаиванием после внесения каждой пробы и продолжительность процесса определения (30-60 мин), а также невозможность определения суммарного количес ва отрицательно заряженных фосфолипидов. Цель изобретения - разработка способа определения суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов и повышение точности определения. Поставлен пая цель достигается тем, что для растворения фосфолипидов используют четыреххлористый углерод, а в качестве раствора красителя используют водный раствор акридинового оранжевого 3 , 1 концентрации, причем степень распределения красителя между двумя фазами определяют путем измерения интенсивности поглощения красителя в водной и органической фазе. Пример. Липиды экстрагировали 20-ти кратным объемом смеси хлороформметанопа 2:1, два раза смесью (1:l) и затем осадок заливали этой же смесью (1:1) и оставляли мл ночь. На следующий день экстракция пипидг-)й 3 проводилась еще дважды смесью хлороформметанола (2:1. Объединенные липидные экстракты отмывали от водорастворимых примесей охлажденным раствором 0,3 Н NaCl добавляемым с таким расчетом, чтобы верхний водный слой содержал не более 50 спирта (дабы он не извлекал фосфолипиды). После центрифугирования верхний водорастворимый слой отсасывался. Пленка, образующаяся на поверхности раздела двух фаз (хлороформенный и водно-спиртовый растворялась добавлением небольшого количества этилового cпиpta. Хлороформенный экстракт, содержащий фосфолипиды упаривали под вакуумом досуха при комнатной температуре. Общее количество липидов определяли весовым методом, сухой остаток растворяли в органическом растворителе - четыреххлористом углероде - СС14, из расчета, чтобы в 1 мл раствора содержалось 2 мг липида. Процесс выделения липидов и определения их в них суммарного количест ва отрицательно заряженных фосфолипи дов проводили при стандартных условиях (комнатная температура - 18 20°С, давление - 76О мм рт. ст. .} К фосфолипидам, растворенным в СС1д добавляют водный раствор акриди нового оранжевого, разделяют органическую и водную фазы отстаиванием в делительной воронке и измеряют интен сивность поглощения красителя в органической и в водной фазах. Вычисляют коэффициент распределения красителя между двумя фазами и определяют количество отрицательно заряженных фосфолипидов по стандартной кривой.- Стандартная кривая строится по известным концентрациям фосфолипиов. Коэффициент распределения краситея между двумя фазами определяют по формуле .%ец . где D((.n - оптическая плотность красителя в органической фазе; оптическая плотность кра сителя в водной фазе; концентрация фосфолипидов. Продолжительность процесса определения мин при 18-20с. Сравнительные данные определения заданного (например, 120 мкг) количества отрицательного заряженного фосфатидилинозита с помощью предлагаемого и известного способами приведены в табл.1. Данные осуществления способа определения заданного (например, 120мкг,) количества отрицательно заряженного фосфатидилинозита при граничных и среднем значениях концентраций водного раствора кр-асителя приведены в табл. 2. Использование предлагаемого способа определения otpицaтeльнo заряженных фосфоли|1идов обеспечивает быстроту и простоту определения, а также более высокую точность анализа в сравнении с известными способами. Т а. б л и ц а

Способ определения отрицательно заряженных

1

3,2-10 АЧО

6-10-З, 1,7

,2

Формула изобретения

Способ определения суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов, включающий выделение фосфолипидов из крови, растворение их, добавление водного раствора красителя, разделение органической и водной фаз в делительной воронке и определение количества отрицательно заряженных фосфолипидов по степени распределения красителя между двумя фазами, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, для растворенияфосфолипидов используют иетыреххлор1 стый углерод, а в качестве раствора красителя используют водный раствор акридинового оранжевого 3 2«10- концентрации, причем степень распределения красителя между двумя фазами определяют путем измерения интенсивности поглощения красителя в водной и органической фазе.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР ff i 125A8, кл. G 01 N 33/02, 06.03-72.