Способ определения концентрации аминофосфолипидов Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

ч

:Ад

со

ел

1 Изобретение относится к биохимии и может быть использовано при биохи мическом анализе фосфолипидов в био логической ткани. Целью изобретения является повыш ние точности способа. Пример, Липлды из биологиче кой ткани экстрагируют 20-кратным объемом смеси хлороформ - метанол При соотношении 2:1, два раза смесью при соотношении 1tI и затем оса док заливают этой же смесью (1:1) и оставляют на ночь. На следующий день экстракщ ю липидов проводят дважды смесью хлороформ - метанол при соотношении 2.: 1 « Объединенные липидные экстракты отмывают от водо растворимых примесей охлажденным раствором 0,3 N NaCl, добавляемым с таким расчетом, чтобы верхний водный слой содержал не более 50% спирта (во избелсание извлечения фосфолипидов}. После центрифугирования верхний водорастворимый слой отсасывают. Планку, образующуюся на поверхности раздег а двух фаз (хлороформенной и водно-спиртовой), растворяют добавлением небольшого количества этилового спирта, Хлороформенный экстракт, содержащий фосфолипиды, упаривают под вакуумом досуха при комнатной температуре. Общее количество липидов определяют весовым методом, сухой остаток растворяют в органическом растворителе - четыреххлористом углероде (СС) из расчета раствора на 1-3 м липидов, Процесс вьщеления липидов и опре деления в них концентрации аминофос фолипидов проводят при стандартных условиях (комнатная температура 18-20с, давление 760 мм рт.ст.) в течение 40-50 , I Таблица Определение с помощью .нингидринового реактива (известный) 15 Продолжение табл.1 пределение онцентрации минофо сфолиидов (предагаемый) Таблица 3 Таблица 4 К фосфолипидам, растворенным в 4 мл ССЦ , дсУбавляют нингидрин в конечной .концентрации 8 мг/мл липид- . ного раствора. Инкубацию проводят при 60 С в течение 10 мин. Раствор фильтруют. Для извлечения из СС14 образовавшегося розоватого комплекса добавляют 4 мл водного раствора Ш СаС. Смесь взбалтывают и оставляют до полного разделения водной и органической фаз в течение 30 мин. Измеряют интенсивность поглощения перешедшего в водную фазу комплекса при длине волны 403 нм и определяют

кол11чество аминофосфолипидов по стан дартной кривой. Стандартная кривая строится по известным концентрациям фосфатидилэтаноламина.

В табл. 1 приведены данные-опреде ления заданного (например, 65 мкг) количества аминофосфолипидов - фосфа тидилэтаноламина известным и предлагаемым способами.

В табл. 2, 3 и 4 приведены данные определения заданного (например,

1733154

65 мкг)кол1гчества фосфатвдилэтаноламипа при различных значениях концентраций нингидрина и при извлечении комплекса npir различных значениях - 5 молярности и объема СаС соответственно.

Как видно из таблиц, использование способа позволяет повысить точность определения концентрации аминофосфолипидов ,

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АМИНОФОСФОЛИПВДОВ путем выделения фракции липидов из биологической ткани, растворения их в органическом растворителе, добавления нингидрина, инкубации реакционной смеси с последующим фотоколориметрированием водной фазы, отличающийся :тем, что, с целью повьпнения точности способа, липиды растворяют в четыреххлористом углероде, нингидрин добавляют в конечной концентрации 610 МГ/Ш1, в реакционную смесь дополнительно вводят 1 М хлористый кальций при соотношении хлористого кальция и реакционной смеси 1:1 с послес ю дующим отделением водной фазы. (Л с