Способ определения фосфолипидов Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохимии и физико-химической биологии и может быть использовано при биохимическом анализе фосфолипидов биохимических препаратов и биологических объектов.

Цель изобретения - повышение чувсвительности способа за счет использования в качестве красителя ртутно- молибденового реактива, разбавленног этиловым спиртом.

Способ осуществляют следующим образом.

К пробе, содержащий фосфолипиды, добавляют четыреххлористый углерод. Затем раствор фосфолипидов обрабатывают ртутно-молибденовым реактивом, разведенным зтиловым спиртом не мене чем вдвое.

Реактив готовят следующим образом.

Раствор А - это 16 г молибдата аммония в 120 МП дистиллированной воды; раствор Б - к 10 мл ртути прибавляют 40 мл НС 1 и 80 мл раствора А

В дальнейшем к остатку раствора А добавляют 200 мл концентрированной серной кислоты и полностью раствор Б При инкубации указанного реактива с этиловым спиртом получают темно-синий раствор. При изменении времени инкубации изменяется окраска комплекса реактив - фосфолипид. Поэтому при количественном определении фос

фолипидов необходимо строго соблюдать ос вой зависимости оптической плотности

время инкубации, при этом не имеет значения инкубируют смесь 10,16 или 24 ч. Важно, чтобы все опыты проводились на реактиве, полученном при определенном времени инкубации.

Пример 1. Липиды из крови крыс экстрагируют 20-кратным объемом смеси хлороформ-метанол 2:1, два раз смесью 1:1 и затем осадок заливают этой же смесью 1:1 и оставляют на ночь. На следующий день экстракцию липидов проводят еще дважды смесью хлороформ-метанол 2:1.

Объединенные липидные экстракты отмывают от водорастворимых примесей охлажденным раствором 0,ЗН NaCl добавлением с таким расчетом, чтобы верхней водный слой содержал не более 50% спирта (чтобы он не извлекал фос- фолипиды) .

После центрифугирования верхний водорастворимый слой отсасывают. Пленку, образующуюся на поверхности раздела двух фаз (хлороформенной и вод-, но-спиртовой) растворяют добавлением небольшого количества этилового спирта. Хлороформенный экстракт, содержащий фосфолипиды, упаривают досуха под вакуумом при комнатной температуре. Общее количество липидов определяют весовым методом, сухой остаток растворяют в органическом раство

рителе ССЬ из расчета,

чтобы в 1 мл 100 мкг лираствора содержалось до пидов.

Процесс вьщеления липидов и определения в них количества фосфолипидов проводят при комнатной температуре.

К липидам, растворенным в 5 мл СС, добавляют 1 мл красителя и инкубируют 10 мин на водяной бане при

. Органическая фаза принимает голубую о.краску. После разделения фаз к органической фазе прибавляют 60%- ную серную кислоту и инкубируют 10 мин на водяной бане при 60 С для устранения мутности раствора (берется 60%- ная серная кислота потому, что при низких концентрациях кислоты мутность органической фазы не исчезает, а 60% и выше уже дают прозрачные растворы комплекса в органической фазе). Разделяют фазы и через 30 мин в органической фазе определяют оптическую плотность комплекса краситель-фосфо- липид при 670 нм. По стандартной кри

от концентрации фосфолипида определяют концентрацию фосфолипида в крови крыс.

Продолжительность процесса опреде - ления 55-60 мин, чувствительность 10 мкг.

Пример 2. Проводят определение в стандартных растворах фосфолипидов так, как описано в примере 1. В табл. 1 представлена зависимость оптической, плотности от концентрации фосфа тидилхолина и смеси фосфатидил- холина и фосфатидилсерина, а в табл. 2 - от концентрации фосфолипидов при разных объемах красителя.

П р и м -е р 3. Проводят определение фос4юлипидов в разных биологических объектах. Данные представлены в табл. 3.

Эти объекты исследуются и поэтому в табл; приведены только данные о количестве фосфолипидов в них. Ходругих клеток и биологических мембран,g

Формула изобретения

тя аналогичным образом можно опреде- ля, разделения фаз и последующего лить концентрацию фосфолипидов и для спектрофотометрирования органической

среды, отличающийся тем, что, с целью повьппения чувствитель- .ности способа, в качестве красителя используют ртутно-молибдеИовый реактив, разбавленный этиловым спиртом Способ определения фосфолипидов не менее чем вдвое, причем краситель путем растворения пробы в четыреххпо- ю берут в соотношении 1-2 мл на 10- ристом углероде, добавления красите- 100 мкг фосфолипидов.

Таблица 1

Фосфолипиды Оптическая плотность при концентрации, мкг

5 I 10 I 20 I 40 I 60 1 80 ПОО Г200 400

Фосфатидилхолин 0,0 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,22 0,23

Фосфатидилхолин + фосфатидилсерин

(1:1) 0,0 0,02 0,04 0,08 0,13 0,17 0,20 0,21 0,22

Таблица 2 Объем кра- Оптическая плотность при концентрации фосфолипидов, мкг

«л 5 I 10 I .20 I 40 I 60 80 100 1 200 1 400 1 600 Т 800 .

10,0 0,020,040,080,120,160,200,220,230,240,24

20,0 0,020,040,080,120,160,200,220,230,240,24 40,080,080,080,080,100,100,250,340,500,700,80 60,08 0,080,080,080,100,100,250,340,500,700,80

ТаблицаЗ Продолжение табл. 3

Объект Количество фосфо--|

липидов, мкг, на Митохондрий пече- сырогоjeca крыс , 26018

2.Лизосомы печени

Эритроциты крови ° крыс234+4

человека21217

Aspergilus niger 80t5

Лимфоциты селезенки крыс19615Aspergilus terues 62t4

ВНИИПИ Заказ 3826/40 Тираж 776 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Изобретение относится к биохи- : мии, предназначено для биохимического анализа фосфолипидов биохимических препаратов и биологических объектов. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Для этого к пробе, содержащей фосфолипиды, добавляют четыреххлористый углерод. Затем раствор фосфолипидов обрабатывают ртутно- молибденовьм реактивом, разведенным этиловым спиртом не менее чем вдвое, краситель берут в соотношении 1-2 мл на 10-100 мкг фосфолипидов. 3 табл. со со tsD tsd К 00