ШТАММ АЦИДОФИЛЬНЫХ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ ACETOBACTER METHYLICUM ВСБ-867 - ПРОДУЦЕНТ БЕЛКОВО-ВИТАМИННОЙ БИОМАССЫ Советский патент 1995 года по МПК C12P1/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма ацидофильных метилотрофных бактерий - продуцента белково-витаминной биомассы на основе матанола.

Известны различные штаммы бактерий, способные развиваться за счет метанола, относящиеся к видам, описанным в определителе Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1974, 8-th Edition, Baltimore, USA) и к новым видам, не вошедшим в существующие определители, например штаммы рода Pseudomonas [1].

Эти штаммы характеризуются различными скоростями роста и выходом биомассы, но все они не могут развиваться при низких значениях рН среды, ниже 7,0-6,5, что не позволяет осуществлять процесс выращивания без соблюдений условий асептики, так как при рН выше 6,0 культуры продуцентов быстро инфицируются посторонней микрофлорой.

Наиболее близким аналогом заявляемого штамма по технической сущности, физиологическим, биохимическим и культуральным признакам является единственный известный селекционированный в ГДР штамм метилотрофных бактерий, растущий при низких значениях рН среды, идентифицированный как Methylobacter аcidophilus [2]. Это - факультативный метилотроф, растущий на среде с метанолом в присутствии дрожжевого автолизата при рН 3,6-4,0 и неспособный расти при рН 6,9. Морфологически представляет собой грамм-положительные подвижные с жгутиком на полюсах клетки, колонии круглые, слегка выпуклые, влажные, край гладкий, светло-желтые, размеры от 0,5 до 1 мм.

Использует сахарозу, фруктозу, глюкозу, глицерин, слабо растет за счет ксилозы, лактозы, некоторых других сахаров, некоторых спиртов, лактата. Не растет за счет пептона, мясопептонного бульона (МПБ) и желатины, нитратов не восстанавливает, сероводорода не образует. На глюкозе и арабинозе образует кислоту.

Растет на синтетических средах с метанолом с временем удвоения около 7,5 ч, что соответствует скорости роста 0,18 ч^-1, накапливая при этом 57-75% белка.

К недостаткам штамма относится низкая скорость роста и нестабильное содержание белка, которое в большинстве случаев ниже 70%, а также потребность в повышенных количествах биостимулятора, в частности автолизата, которая проявляется при выращивании штамма в асептических лабораторных условиях, что показано при испытании Methylobacter acidophilus в СССР.

Цель предлагаемого изобретения состояла в селекции нового штамма метилотрофных бактерий, способных развиваться при низких значениях рН среды с более высокой скоростью роста, стабильно высоким содержанием белка и менее выраженной потребностью в биостимуляторах.

Поставленная цель достигается использованием нового штамма метилотрофных бактерий Acetobacter methylicum ВСБ-867 - продуцента белково-витаминной биомассы, способного развиваться на средах с метанолом при низких значениях рН среды (2,0-6,0) с повышенной скоростью 0,15-0,16 до 0,2 ч^-1 (время пребывания около 5 ч), обеспечивать стабильно высокое содержание белка в биомассе 70-76% , а также обладающий сниженной потребностью в биостимуляторах (факторах роста).

Предлагаемый новый штамм метилотрофных бактерий Acetobacter methylicum ВСБ-867 выделен из спонтанного микробного комплекса, образующегося в процессе ферментации метанола в нестерильных условиях, и далее селекционирован в процессе длительного пассирования на жидких средах с метанолом.

Идентификацию предлагаемого штамма проводили по определителю бактерий (Bergey's Мanual of Determinative Bacteriology, 1974, 8-th Edition, Baltimore, USA) с привлечением описания ацидотолерантного метилотрофа - аналога Methylobacter acidophilus.

Систематическая принадлежность этого штамма аналога в настоящее время его авторами пересматривается, его относят к группе уксуснокислых бактерий, считая близким к бактериям рода Gluconobacter.

Заявляемый штамм бактерий ВСБ-867 по способности к росту при низких значениях рН, образованию ацетата из этанола может быть отнесен в соответствии с описанием бактерий в определителе (Bergey's) к группе уксуснокислых бактерий и ближе всего подходит по этим описаниям к бактериям рода Acetobacter. Однако способность заявляемого штамма ВСБ-867 хорошо расти за счет метанола, не отмеченная в определителе ни для одного представителя уксуснокислых бактерий, позволяет идентифицировать штамм ВСБ-867 как новый вид рода Acetobacter.

Штамм Acetobacter methylicum депонирован в центральной коллекции промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" Главного управления микробиологической промышленности при Совете Министров СССР под номером ЦМПМ В-1947.

Штамм ВСБ-867 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки в форме палочек с закругленными концами, расположенные поодиночке или попарно, могут образовывать короткие цепи. Размеры односуточных клеток с синтетической среды 0,35-0,56 х 0,7-1,05 мк. Бактерии грамотрицательны, размножаются бинарным делением, спор не образуют. Клетки подвижны, с полярными жгутиками. Колонии на агаризованной синтетической среде с метанолом круглые, выпуклые, гладкие серовато-белого цвета слизистой консистенции с диаметром 1-2 мм.

Физиологические и культуральные признаки. Облигатный аэроб растет при низких значениях рН (2,0-6,0). Максимальный рост при рН 3,0-4,5, при рН 7,0 рост прекращается. Оптимальная температура 30-32^оС. Факультативный метилотроф. Кроме метанола использует сахара: глюкозу, фруктозу, мальтозу, спирты: этанол, глицерин, маннит, дульцит; органические кислоты: ацетат, пируват, лактат, пропионат. Не растет на сахарозе, арабинозе, рамнозе, лактозе. На средах с этанолом образует уксусную кислоту. Растет на мясопептонном агаре (МПА), на МПБ в виде пленки на поверхности, желатину не разжижает. В качестве источника азота используют соли аммония, хуже нитраты. Нитриты не восстанавливает, способности к ассимиляционной нитрат-редукции не проявляет, сероводорода не образует. Тесты на оксидазу и каталазу положительные. Слизи не образует. Нуждается для роста в автолизате или пантотеновой кислоте.

Молярное соотношение гуанина и цитозина в ДНК составляет 63,0 ± 0,3.

Предлагаемый штамм Acetobacter methylicum ВСБ-867 непатогенен.

Штамм ВСБ-867 хорошо растет на среде с метанолом при низких значениях рН со скоростью до 0,2 ч^-1, стабильно высоким содержанием белка 71-76%. Выход биомассы к заданному метанолу составляет 35-37%. Штамм даже в асептических лабораторных условиях способен к ограниченному росту без добавок биостимуляторов (факторов роста).

Штамм устойчив к вытеснению инфицирующей микрофлорой. При длительном непрерывном выращивании в нестерильных условиях количество инфицирующей микрофлоры не превышает 10%.

Штамм нелизогенен, легко поддерживается в лабораторных условиях на твердых и жидких средах.

Предлагаемый штамм Acetobacter methylicum ВСБ-867 отличается от наиболее близкого Methylobacter acidophilus по ряду существенных признаков (см. таблицу).

Из таблицы видно, что заявляемый штамм ВСБ-867 отличается от прототипа Methylobacter acidophilus как по культурально-морфологическим признакам, так и по антигенному составу, что выявляется различиями в реакции с иммунно-флуоресцентными сыворотками. Известный штамм не реагирует с иммунно-флуоресцентной сывороткой, приготовленной к заявляемому штамму, а заявляемый штамм не дает реакции с сывороткой к прототипу.

Заявляемый штамм обладает более высокой скоростью роста - время пребывания 5 ч вместо 7,5 и более стабильным содержанием белка, менее выраженной потребностью в биостимуляторах (факторах роста), в частности в автолизате.

П р и м е р 1. Штамм бактерий Acetobacter methylicum ВСБ-867 выращивают непрерывным способом в нестерильных условиях в ферментере с полезным объемом 15 л при температуре 30^оС и рН 4,0 на минеральной среде с метанолом следующего состава (на 1 кг сухой биомассы), г: Н₃РО₄ 60,0 MgSO₄ ˙ 7H₂O 24,6 KCl 26,7 CuSO₄ ˙ 5H₂O 0,235 CoSO₄ ˙ 7H₂O 0,24 MnSO₄ ˙ 5H₂O 0,51 FeSO₄ ˙ 7H₂O 0,99 H₃BO₃ 0,52 Na₂MoO₄ 0,08 ZnSO₄ ˙ 7H₂O 0,4
Источником азота служит раствор аммиака, который одновременно используют и для поддержания рН на заданном уровне. Концентрация метанола в приточной среде 4 об.%.

Непрерывное выращивание осуществляют при скорости протока 0,2 ч^-1 (время пребывания 5 ч). При этой скорости биомасса содержит 72% белка и выход биомассы составляет 37% к заданному метанолу. В течение 10 суток непрерывного выращивания штамм сохраняет стабильность: инфицирующая микрофлора составляет 1-5%.

П р и м е р 2. Штамм бактерий Acetobacter methylicum ВСБ-867 выращивают таким же способом и на такой же среде, как в примере 1, но в ферментере с полезным объемом 800 л. Метанола в приточной среде дают 7%. Непрерывное выращивание осуществляют при скорости протока 0,15 ч^-1. При этом содержание белка в биомассе составляет 76%.

В течение 60 суток непрерывного выращивания в нестерильных условиях штамм держится стабильно, инфицирующая микрофлора не превышает 1%.

П р и м е р 3. Штамм бактерий Acetobacter methylicum ВСБ-867 выращивают в колбах на качалке при температуре 30^оС и рН 4,2 на минеральной среде следующего состава: NH₄H₂PO₄, г/л 2,0 (NH₄)₂HPO₄, г/л 0,5 MgSO₄, г/л 0,2 К₂SO₄, г/л 0,2 KI, мг/л 0,2 Н₃ВО₃, мг/л 0,2 MnSO₄ ˙ 5H₂O, мг/л 0,2 (NH₄)₂ MoO₄, мг/л 0,2 FeSO₄ ˙ 7H₂O, мг/л 1 Метанол, мл/100 мл 0,5
Автолизат и какие-либо другие биостимуляторы или факторы роста не вводят. Колбы засевают смесью культур c сусло-агара и синтетической среды с метанолом.

Штамм развивается на этой чисто минеральной среде с метанолом без добавок. Выход после двух суток доходит до 1,0 ед. оптической плотности.

П р и м е р 4. Штамм Acetobacter methylicum ВСБ-867 выращивают так же, как в примере 3, но при рН 2,0. В среду вводят дрожжевой автолизат в количестве 0,1%. Выход по оптической плотности после двух суток роста составляют 1,3 ед.

П р и м е р 5. Штамм бактерий Acetobacter methylicum ВСБ-867 выращивают при тех же условиях, что и в примерах 3 и 4, но при рН 4,2. Выход после двух суток роста по оптической плотности составляет 1,7 ед.

П р и м е р 6. Штамм бактерий Acetobacter methylicum ВСБ-867 выращивают в тех же условиях, что и в примере 4, но при рН среды, равном 6,0. Выход биомассы по оптической плотности составляет 1,4 ед.

П р и м е р 7. Штамм бактерий Acetobacter methylicum ВСБ-867 выращивают в тех же условиях, что и в примере 4, но при рН среды 7,0. Бактерии не растут.

Таким образом, селекционирован новый штамм метилотрофных бактерий Acetobacter methylicum ВСБ-867, способный развиваться при низких значениях рН среды (2,0-6,0), повышенной скорости роста (до 0,2 ч^-1), и обеспечивать стабильно высокое содержание белка (71-76%), обладающий сниженной потребностью в биостимуляторах (факторах роста). Селекционированный штамм в нестерильных условиях не вытесняется посторонней микрофлорой, хорошо поддерживается в чистых культурах и жидких средах.

Предлагаемый штамм Acetobacter methylicum ВСБ-867 представляет собой первую в СССР ацидофильную культуру метилотрофных бактерий и имеет существенные преимущества перед известным ацидофильным штаммом метилотрофных бактерий Methylobacter acidophilus: растет с более высокой скоростью, обеспечивает более стабильным содержанием белка, проявляет менее выраженную зависимость от биостимуляторов (факторов роста).

В отличие от мезофильных штаммов бактерий - метилотрофов - в части штаммов Pseudomonas methanolica и КИ-4, применяемых в СССР в качестве продуцентов белково-витамминной биомассы из метанола, которые при попадании инфекции нацело вытесняются из процесса, предлагаемый штамм может длительное время развиваться в нестерильных условиях без существенного инфицирования посторонней микрофлорой.

Селекция нового штамма позволяет расширить имеющийся фонд ацидофильных метилотрофов. Применение штамма позволит обеспечить стабильный процесс получения микробной биомассы из метанола в нестерильных условиях, а благодаря более высокой скорости роста и другим преимуществам по сравнению с единственным имеющимся штаммом ацидофильных метилотрофов уменьшить стоимость этой биомассы.

ШТАММ АЦИДОФИЛЬНЫХ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ ACETOBACTER METHYLICUM ВСБ-867 - ПРОДУЦЕНТ БЕЛКОВО-ВИТАМИННОЙ БИОМАССЫ.

Штамм ацидофильных метилотрофных бактерий Acetobacter methylicum ВСБ-867 (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов Института "ВНИИгенетика" N ЦМПМ В-1947) - продуцент белково-витаминной биомассы.