Штамм облигатно-метилотрофной бактерии @ @ ВСБ-792 Советский патент 1985 года по МПК C12P21/00 C12P21/00 C12R1/26 

Изобретение относится к области микробиологического синтеза белка и физиологически-активных соединений и представляет собой новый штамм бактерий - продуцент белкововитаминной биомассы на основе метанола. Получение микробной биомассы на основе метанола - один из эффективных путей обеспечения народного хозяйства и, в первую очередь, животноводства белково-витаминными концентратами. Планами развития народного хозяйства предусматривается организация крупнотоннажного промыш ленного производства микробной биомассы из метанола, как источника кормового белка и витаминов. Создание отечественного фонда культур, активно растущих за счет метанола и обладающих ценными для производства признаками, является необходимым условием развития такого производства и представляет собой важную народнохозяйственную задачу. Известно много различных штаммов бактерий-метилотрофов, способных развиваться за счет метанола СО Систематика этих бактерий мало разработана и многие из селекционированных штаммов их авторы относят к новым видам и даже новым родам, не описанным в существующих определителях, в частности в наиболее полном определителе бактерий (Bergeys manual of Determinative Bacteriology, 1974,8-th Edition,Balt more, USA) , Большинство известных штаммов метилотрофных бактерий охарактеризовано, однако, лишь в условиях периоди ческого культивирования или не представляет практического интереса благодаря недостаточно высоким для промьшшенного применения показателям. Из числа известных штаммов основная масса принадлежит факультативным метилотрофам, способным помимо мета нола потреблять источники углерода, содержащие два и более углеродных атома. Значительно меньше найдено облиг ных метилотрофов, хорошо растущих только за счет одноуглеродных соеди нений, в частности метанола, В СССР штаммов облигатных метило трофов нет, а для получения белково витаминной биомассы из метанола предложены два факультативно-метшютрофных штамма Pseudomonas methanolica sp, nev, и КИ-4 C2j. Но эти штаммы очень неустойчивы к инфицирующей микрофлоре, полностью вытесняются посторонней микрофлорой из процесса, обладают сравнительно низкой скоростью роста, растут при скорости протока 0,16-0,18 ч с невысоким выходом биомассы (около 40%), уступая по указанным показателям облигатнометилотрофным штаммам, предлагаемым за рубежом. Наиболее близким к предложенному штамму по технической сущности, физиолого-биохимическим и культуральным признакам является облигатно-метилотрофный штамм Methylobacillus glucogenes gen, nov, sp, nov, pj, Это облигатный метилотроф и облигатный аэроб, хорошо растущий на минеральной среде с метанолом при и рН 6,8-7,0, Из источников углерода использует только метанол и метиламин. Морфологически, представляет собой неподвижные на всех стадиях палочки, размером 0,5-0,8x1,0-1,6 мкм, встречающиеся поодиночке и парами, спор не образует. Окраска по. Грамму отрицательная, тест на каталазу положительный. Колонии на синтетической среде с метанолом округлые диметром около 0,4 мм, блестящие, гладкие, непигментированные. Молярное содержание гуанина и цитозина в ДНК составляет 54,1 молярных %, Поли- -оксимасляной кислоты не накапливает, но в определенных условиях лимита по азоту образует гликогеноподобнсге вещество. Оптимальная температура - 30, при 37°С рост прекращается. При оптимальных значениях температуры и рН (около 7) максимально короткое время удвоения составляет 2,9-3,5 ч, что соответствует скорости роста 0,28-0,43 ч ., Штамм испытан при периодическом выращивании в условиях качалочных опытов. По выходу биомассы и содержанию в ней белка штамм не охарактеризован, К недостаткам штамма, которые выявляются даже в условиях периодического выращивания, относятся недостаточно высокая скорость роста и низкий температурный оптимум, Цель изобретения состоит в селекции нового штамма метитотрофных бактерий с улучшенными свойствами. Для достижения цели предложен штамм облигатно-метилотрофной бактерии Methylobacillus methylophilus ВСБ-7 (коллекция Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов) - продуцент белково-витамин ной биомассы. Пример 1. Предлагаемый штамм Methylobacillus raethylophil ВСБ-792 выделен из бактериального комплекса, спонтанно образовавшегося в процессе непрерывной ферментации метанола в нестерильных условия при рН 6,8-7,0. Идентификацию предлагаемого штам ма проводили по определителю бактерий (Bergeys manual of. Determ. 3act.,8-th. Ed. Bait. USA) и описа ниям облигатных метилотрофов в оригинальных статьях, перечисленных в табл. 1. Из таблицы видно, что по сумме признаков предлагаемый штамм ВСБ-792 ближе всего подходит к облигатно-метияотрофным бактериям рода Methylobacillus. Предлагаемый штамм как и бактерии рода Methylobacillus, помимо ряда общих с други ми облигатными метилотрофами призна ков, отличает отсутствие подвижности, отсутствие пигментации и близкое молярное соотношение в ДНК сумм гуанина и цитозина. На основании сходства морфологических и культуральных признаков заявляемый штамм ВСБ-792 отнесен к роду Methylobacil lus и на основании имеющихся отличий от единственного известного вида этого рода Methylobacillus glucogenes (см. таблицу) определен как новый вид Methylobacillus methylophilus sp. nov. Штамм Methylobacillus methylophi lus ВСБ-792 депонирован в центральной коллекции промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика Главного управления микробиологической промьш1ленности при Совете Министров СССР под номером ЦМПВ В-1946. Штамм ВСБ-792 характеризуется следующими свойствами. Морфологические признаки. Клетки в форме палочек с закругленными концами, расположенное пооди ночке или попарно, могут образовывать длинные нити, неподвижны, жгути 74 ки не обнаружены, Р.азмеры односуточных клеток с синтетической среды 0,3-0,5 X 1,5-1,8 мкм, размножаются бинарным делением, спор не образуют. Окраска по Грамму отрицательная. Колонии на агаризованной синтетической среде с метанолом округлые до мм в диаметре, выпуклые, с гладким краем, блестящие, полупрозрачные, непигментированные. Физиологические и культуральные признаки. Облигатный аэроб, максимум роста при рН 6,8-7,0 и температуре 30-35, хорошо растет при З7с. Облигатный метилотроф. Не использует соединения с двумя и более углеродными атомами: спирты (этанол, пропанол, изо-пропанол, н-бутанол, изо-бутанол, амиловый и изоатиловый спирты, глицерин, маннит, дульцит), органические кислоты (формиат, ацетат, оксапат, гликолат, пируват, лактат, пропионат, сукцинат, бутират, фумарат, малат, малеат,о -кетоглутарат, цитрат), сахара (глюкозу, фруктозу, сахарозу, галактозу, ксилозу лактозу, мальтозу, рамнозу). Из С-соединений хорошо растет только на метаноле. Метан, метиламины, формальдегид и формиат не потребляет. Не растет на обычных средах - молоке, мясо-пептонном агаре (МПА), мясопептонном бульоне (МПБ), мясопептонной желатине. В качестве источника азота использует соли аммония, хуже нитраты. Нитриты из нитратов не образует. Сероводород, индол, поли- 5 оксимасляную кислоту не образует, но может вьщелять в среду большое количество слизи (полисахариды) . Ауксоавтотроф, в витаминах и других дополнительных факторах роста не нуждается. Тесты на каталазу и оксидазу положительны. Молярное содержание гуанина и цитозина в ДНК составляет 55,7+0,4 молярных %. Предлагаемый штамм ВСБ-792 непатогенен. Штамм ВСБ-792 хорошо растет на инеральных средах с метанолом с ысокой скоростью роста до D 0,5 ч (время удвоения до 2 ч) , арактеризуется высоким выходом иомассы, который может превьш1ать 0% к заданному метанолу, и высоким одержанием белка (сырой протеин) более 80% к сухому весу,.а также соединенный витаминной и коферментной природы, в частности витамина BZ до 100 мкг/г, из них до 70 мкг/г в коферментной форме в виде флавина дениндинуклеотида (ФАД), а также более 1000 мкг/г никотинамиддинукле отида (НАД-кофермента), Штамм стабилен при непрерывном выращивании, легко поддерживается в лабораторных условиях, нелизогене Предлагаемый штамм Methylobacillus methyloph. ВСБ-792 отличается от наиболее близкого прототипа Methylobacillus glucogenes по следующим признакам: не использует, мети амин, не накапливает гликогеноподоб ного вещества при дефиците азота, обладает более высокой скоростью роста - Д 0,5 , вместо Д -0,280,34 ч у прототипа (или по минимальному времени удвоения - 2 ч по сравнению с 2,9 ч у прототипа) хорошо растет в более широком интерва ле температур: у прототипа при рост прекращается, а заявляемы штамм продолжает развиваться при 37-38 С. Влияние температуры на рос заявляемого штамма представлено в табл. 2. Из таблицы видно, что предлагаемый штамм ВСБ-792 одинаково хорошо растет при 30 и , а при 38С отмечается лишь небольшое снижение выхода. Пример 2. Штамм Methylobacillus -methylophilus ВСБ-792 выращивали непрерывным способом в асептических условиях в лаборатор ных аппаратах 0,7 л с полезным объемом 0,3 л при рН 6,8-7,0 и на среде состава г/л: О FeS04 -7Н,,0 inso4 MnSO -SHjO 0 НзРО(70%) 58 мл Концентрация метанола в притоке составляла 1%. Источником азота слу жил акв4иак, который вводили по мере подкисления среды. Выращивание проводили при скорое ти протока Д-0,25 ч В этих услови выход биомассы по абсолютно сухому веществу к заданному метанолу соста лял в среднем 52%, Биомасса содержала в пересчете на абсолютно сухое вещество 85% сырого протеина, 106:мкг/г витамина В, 70 мкг/л флавинадениндинуклеотида (ФАД) 1200 мкг/г никотинамиддинуклеотида (НАД), 3-8% липидов. Пример 3. Штамм Methylobacillus methyloph ВСБ-792 культивировали так же как в примере 1, Но при , при той же, что в примере 1 скорости протока Д-0,25 ч , Выход биомассы по абсолютно сухому веществу к заданному метанолу составлял 52%. Пример 4. Штамм Methylobacillus methylophil. ВСБ-792 культивировали в тех же условиях, что и в примере 1, но при температуре выращивания З8с. Выход биомассы к заданному-метанолу составлял 47%. Пример 5. Штамм Methylobacillus methylophil ВСБ-792 культивировали тем же способом, что и в примере 1, но в аппаратах емкостью 30 л, в нестерильных условиях и скорость протока доводили до Д-0,4 ч. Выход биомассы по абсолютно сухому веществу при скорости протока Д-0,4 ч составлял 54% к заданному метанолу, содержание сырового протеина доходило до 85%. За 140 ч выращивания в нестерильных условиях штамм не вытеснялся из процесса инфицирующей микрофлорой и не менял своих свойств. Пример 6. Штамм Methylobacillus methylophilus ВСБ-792 культивировали так же и в тех же аппаратах, что в примере 4, но скорость протока доводили до Д-0,5 . Выход биомассы по абсолютно сухому веществу к заданному метанолу при Д - ,0,5 ч составлял 46%. Таким образом, селекционирован новый штамм облигатно-метилотрофной бактерии Methylobacillus methyloph. ВСБ-792 с улучшенными свойствами, способный активно развиваться на средах с метанолом с высокой скоростью роста до Д-0,5 ч, в широких пределах температуры до 38С с оптимумом 30-35С и обеспечивать высокий выход биомассы, более 50% к заданному метанолу. Штамм образует более 80% сырого протеина, а также ценные соединения витаминной и кофе ментной природы, в частности, витамин Bj около 100 мкг/г сухого веса, в том числе около 70 мкг/г в виде I флавинадениндинуклеотида (ФАД) и более 1000 мкг/г никотинамиддинуклеотида (НАД-кофермент), Штамм выделяет в среду в определенных условиях большие количества полисахарида, который может иметь практическое значение. Штамм Methylobacillus methylophi ВСБ-792 представляет собой первую в СССР культуру облигатно-метилотро ных бактерий. Этот штамм, как продуцент белково-витаминной биомассы, не уступает по промьшшенно-Ценным свойствам лучшим зарубежным штаммам облигатно-метилотрофных бактерий, предлагаемым для производства микро ной биомассы на основе метанола и по некоторым показателям превосходит их. Заявляемый штамм имеет существенные преимущества перед факул тативно-метилотррфны ш бактериями, в том числе используемыми в СССР в качестве продуцентов микробной биомассы на основе метанола Pseudomona methanolica и Pseudomonas KU-4. Сравнение показателей селекциони рованного штамма Methylobacillus methylophilus с используемыми в СССР факультативно-метилотрофными штаммами представлено в табл. 3. Из представленной таблицы отчетливо видны преимущества заявляемогц штамма перед используемыми в настоя- щее время в СССР. Применение предлагаемого штамма позволит за счет более высокой скорйсти роста, способности к росту в более широких пределах температуры, а также высокому выходу богатой белком биомассы и большей устойчивости к вытеснению инфицирующей микрофлорой в два с половиной раза уменьшить стоимость биомассы на метаноле, обеспечить более стабильный процесс с меньшей вероятностью вытеснения продуцента при инфицировании, а также расширить общЬй фонд имеющихся облигатных метилотрофов и фонд штаммов-продуцентов белково-витаминной биомассы на основе метанола, имеющийся в СССР. Экономия от внедрения предлагаемого штамма вместо используемого в настоящее время для опытной установки производительностью по микробной биомассе 10 тыс. т в год составит по предварительным расчетам 530 тыс. руб.

я)

а гз ч ю

tx)

н

о

U

о г

а пз и и

989867

Выход биомассы у штамма ВСБ-792 в услобиях непрерывного выращивания при разных температурах

12

Таблица 2

Штамм облигатно-метилотрофной бактерии Methylobacillus methylophllus БСБ-792 (коллекция Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов №ЦМПМ В-1946 - продуцент белково-витаминцой биомассыГ (Л