Способ определения таксономической принадлежности микроорганизмов Советский патент 1988 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 

(Л

с

Изобретение относится к микро - биологии. Цель изобретения - ускорение способа. Исследуемую суспензию микроорганизмов разделяют на несколько проб, в которые добавляют различные флуорогенные субстраты, расщепляемые внутриклеточными ферментами микроорганизмов. После инкубации определяют величину флуоресценции каждой пробы, строят профиль исследуемой суспензии и сравнивают с контролем, выбирают наиболее близкий профиль и определяют таксономическую принадлежность микроорганизмов. 1 з.пф-лы, 2 ил.

iOb Jiiii

О со

1

Изобретение относится к микробиологии, в частности для быстрой идентификации микроорганизмов в медицинской микробиологии и выявления промышленных загрязнений в биотехнологии.

Цель изобретения - повышение чувствительности и ускорение способа.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. КЗмл суспензии клеток Е. coli М-17 с концентрацией 10 кг/мл, приготовленной на физиоло14

гическом растворе добавляют 0,3 мл раствора 4-метилумбеллиферилфосфата (0,1 мг/мл в диметилсульфоксиде) к трем другим аналогичным пробиркам добавляют раствор 4-метш1умбеллиферил- ацетата, 4-метилумбеллиферилбултира- та, 4-метилумбеллнферилпальмитата. Исследуемые пробы помещают в водяную баню при 40 С на 15 мин, после, чего быстро охлаждают до 4-5 С и флуори- метрируют. Длину волны возбуждений флуориметра устанавливают на 320 нм, тлина волны флуоресценции 450 нм. По полученным величинам флуоресценции каждой пробы строят профиль исследуемой суспензии клеток, который сравнивают с предварительно полученными профилями, выбирают наиболее близкий к полученному и делают вывод о таксонономической принадлежности клеток (фиг. 1).

П р и м е р 2. Суспензию клеток В. thuringiensis (концентрация 10 кл/мл), выращенную на МПА 17 ч и приготовленную на физиологическом растворе, разливают в три пробирки п 3 мл в каждую. К первой добавляют 0,3 мл раствора 4-метилумбеллиферилфосфата (с концентрацией 0,1 мг/мл н диметилсульфоксиде), к второй 0,3 мл раствора флуоресцеиндиацетата (0,1 мг/мл на ацетоне), к третьей 0,13 мл раствора резазурина (0,1 мг/м на дисталлированной воде). Полученные смеси инкубируют 15 мин при 40 С на водяной бане, охлаждают до 5-6 С и флуориметрируют: первый раствор им,Яф 450 нм, второй/ 0(73j 470 нм, 5 15 нм, третий раствор Ядд 520 им, .570 нм. Строят профиль величин флуоресценции, по которму судят о таксономической принадлеж ности исследуемой культуры клеток

15

20

25

30

4409172

(фиг. 2). Для простоты измерения можно использовать одну общую для всех крагителей Л .возбуждения (ближний г ультрафиолет). Использование фцуорес- цендии позволяет определять исключительно малые концентрации клеток, так как чувствительность может быть практически неограничено повышена за счет JO увеличения интенсивности возбуждающего флуоресценции света (использование более мощных ламп, лазеров) и увели- чения времени инкубации клеток с субстратом,.

Способ может найти применение в практике санитарно-бактериологических лабораторий для быстрого и точного определения видовой принадлежности выросших на питательных средах микроорганизмов по полученным профилям,в частности для определения малых количеств санитарно-значимых микроорганизмов в пробах воды, воздуха, продуктов или пробах, взятых с поверхностей. Используемые известные практике методы требуют затрат времени на определение от нескольких часов до нескольких суток. Использование предлагаемого способа, при со хранении надежности определения составляет 10-30 ТУГЯН,

0 5 п е

5

Формула изобретения

}. Способ определения таксономической принадлежности микроорганизмов путем инкубирования отдельных проб исследуемой суспензии с флуорогенны- ми субстратами с последующим определением таксономической принадлежности микроорганизма по величине флуоресценции, полученной в результате взаимодействия ферментов микроорганизмов с субстратом., о т л и ч а ю щ и й- с я тем, что, с целью повьппения чувствительности и ускорения способа, в качестве флуорогенных субстратов используют вещества, расщепляемые внутриклеточными ферментами микроорганизмов .

2. Способ по п. I, отличающийся тем, что в качестве флуорогенных субстратов используют 4-метилумбеллиферон, 4-метилумбелли- ферилацетат, 4-метилумбеллиферилпи- рофосфат, 4-метилумбеллиферилсульфат, резазурин и/или флуоресцеин.