Способ определения количества жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий в ризоторфине Советский патент 1991 года по МПК C12N1/00 C12Q1/00 C05F11/08 

о

СП

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для оценки качества в производстве бактериального удобрения ризоторфина.

Цель изобретения - ускорение и упрощение способа.

Способ заключается в следующем. .Суспензию ризоторфина в поливиниловом спирте фильтруют через бумажный фильтр, центрифугируют, осадок клеток ресуспендируют в буферном растворе и инкубируют с субстратом 4-нитрофенил- -Р-глюкопиранозидом, гидролизуннцимся ферментом ji-глю- козидазой, в присутствии толуола в течение 2 ч npH ST C. Окрашенные образцы фотометрируют при 430-А40 им на спектрометре (фотозлектрокалори- метре) и ноЛученные значения оптической плотности сравнивают со значе- нием оптической плотности для суспен- . зионных культур клубеньковых бактерий с известным титром жизнеспособных

клеток.

Таким образом, сущность изобретения заключается в определении количества жизнеспособных 1шеток клубень- . ковых бактерий по их -гликозидаз- ной активности, которая служит показателем их жизнеспособности.

В таблице приведены данные по определению активности -глюкозидазы в суспензиойных культзграх клубенько- вых бактерий люцерны, при йрогревании бактериальной суспензии при 45°С в течение различных промежутков времени

Указанные культуры, таким образом, содержат .различные количества жизне- способных клуб еньковьк бактерий, чему соответствуют разные величины J-глю козидазной активности.

Для определения количества жизнеспособных клеток в бактериальном препарате ризоторфине необходимо отделить клетки бактерий от частиц наполнителя - торфа, что достигается приготовлением суспензии ризоторфина на 1%-ном растворе поливинилового спирта, являющегося поверхностно-активным веществом, при помощи которого достигается иммобилизация бактериальных клеток со 100%-ным сохранением их жизнеспособности и активности ферментов, в том числе и -глю- козидазы.

Пример 1.К1г бактериального препарата ризоторфина для люцерны вводят 10 МП 1%-ного,раствора поливинилового спирта на дистиллированной воде и встряхивают на качалке при 180 об/мин в течение 30 мин при . Суспензию фильтруют через бумажный фильтр на воронке Бюхнера с водоструйным насосом. Фильтрат разбавляют в 2 раза дистиллированной водой, центрифугируют при 7000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М ацетатного буфера (рН ё,5), добавляют 10 мкл то- луола, встряхивают при 180 об/мин в течение 20 мин при добавляют 0,1 МП субстрата 4-нитрофенил- -0- глюкопиранозида в 0,1 М ацетатном буфера (рН 6,5 при концентрации субстрата 10 мг/мл), инкубируют 2 ч при 37°С.

Фотометрирование проводят на спектрофотометре при 440 нм или на фото- электрокалориметре (зеленый светофильтр). Значение 440 равно 0,30, что соответствует количеству жизнеспособных клеток 4,5-10 в 1 г.

При посеве препарата на питательную среду (контроль известным методом титр клеток равен 4,710 в 1г. Таким образом, способ позволяет получить вполне достаточную точность при значите {ьном вьигрьше времени (3,5 ч вместо 5 сут,).

Пример 2. Опыт ставился точ но так же, но был использован ризотор фин для люцерны, хранившийся в течение 3 мес. Предлагаемый способ показал значенне 0,9«10 клеток в 1 г; обычным способом было получено значение клеток.

Пример 3. Опыт ставился точ- но так же, но бьш взят риэоторфии для гороха Предлагаемый способ 3 1410518 эначение 7,2-10 клеток, изм способом было получено зна7,4-Ю .

от пе та с о це от ни ви су дя

Таким образом, предлагаемый способ позволяет производить экспресс-, оценку качества препарата ризоторфи- на по содержанию в нём жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий без применения каких-либо дефицитных и дорогих приборов. Способ может быть так- же использован для анализа ку. :ьту- ральиых жидкостей, т.е. для контроля процесса ферментации.

Ф о Р м У л а и 3 о б р е т е н и я

.Способ определения количества жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий в ризоторфине, предусматривающий приготовление суспензии ризо торфина отделение клеток бактерий

18

от наполнителя, приготовление суспензии бактерий, добавление субстрата, инкубирование полученной смеси с последующей оценкой результатов, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, отделение клеток бактерий от .наполнителя осуществляют раствором поливинилового спирта, перед введением субстрата в суспензию бактерий вво- дят толуол, в качестве субстрата испольэуЮт 4-нитрофенил-р-1)-глюкопираио зид, после инкубирования смеси рпре«- деляюх оптическую плотность лизата, полученного в процессе инкубирования смеси, путем фотометрирова- ния при 430-440 нм, а оценку результатов осуществляют путем сравнения OB тнческой плотности гидролизата с эталонными суспензияьш бактерий, содержащих известное количество жизнеспособных бактерий.

Предлагаемый способ относится к йеяьскохоэяйственной микробиологии и Может быть использован для оценки качества бактериального удобрения ризоторфина. Целью изобретения является ускорение и упрощение способа. Способ заключается в следующем. Суспензию риэоторфима в 1%-ном поливи-, ниловом спирте фильтруют, центрифугируют, осадок клеток ресуспендируют в буферном растворе и инкубируют с :. субстратом 4-иитрофенил -1)-глюко- пиранозидом, гидролизующимся ферментом -глюкозидазой в присутствии толуола, в течение 2 ч при З7 с, окрашенные образцы фотометрирукот при 430-440 нм на спектрофотометре и полученные значения оптической плотности сравнивают со значением оптической, плотности для суспензионных культур клубеньковых бактерий с известным титром жизнеспособных клеток. 1 табл. (Л