Способ регенерации носителей для иммобилизации ферментов Советский патент 1982 года по МПК B01J21/20 C12N11/08 

(5) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к способу регенерации носителей и может быть использовано при получений активированных носителей для иммобилизации ферментов. Известен способ регенерации носителей для иммобилизации ферментов путем обработки носителя разбавленной СОФ1НОЙ кислотой. Обработка кислотой регенерирует альденидные группы на носителе, через которые производят иммобилизацию фермента 1 Недостатком способа является его пригодность только для носителей, содержащих альдегидные группы. Иммо билизация через альдегидные группы всегда дает достаточно стабильные препараты иммобилизованных ферменто Цель изобретения - увеличение количества активных групп на носите ле для получения высокоактивных и стабильных иммобилизованных фермент ных препаратов на основе органоминеральных носителей. Поставленная цель достигается тем,что согласно способу регенерации органоминеральные носители сначала кипятят в растворе брома в четыреххлористом углероде, а затем обрабатывают раствором цианистого калия в этиловом .спирте. Пример 1.5г силохгома, покрытого полимерной пленкой - эпок-, сидной смолой, с инактивированным ферментным препаратом помещают в колбу и добавляют 18мл 0,5 -ного раствора брома, приготовленного путем растворения 0,1 г (0, мл) брома в четыреххлористом углероде. Полученную смесь нагревают с обратным холодильником при в течение 20 мин. После этого растворитель и летучие вещества удаляют дистилляцией, в результате чего материал высушивается. Получают продукт, по3.9 верхыост - которого покрыта пленкой, имеющей в цепи полимера активный бром, 0, г цианистого калия растворяют в 20 мл этанола (0,3% раствор) и добавляют к вышеупомянутому продукту. Полученный таким образом носитель промывают этанолом до исчезновения ионов цианида в промывно растворе. Получают носитель, активи рованный цианидом калия. Количество активных групп на носителе определяют путем перемешивания носителя в растворе метиламина в течение 60 мин и обратного титрований непрореагирующих аминогрупп 0,1 н.раствором соляной кислоты. Со держание активных групп в регенерированном носителе мк-экв/г. К 1 г регенерированного носителя добавляют 2,5 мл боратного буфера с рН 8,0, содержащего 60 мг трип сина и 3 мг ингибитора трипсина.Реа цию иммобилизации проводят при комнатной температуре в течение 20 ч. После этого препарат промывают посл довательно боратным буфером с рН 8,0, 1 м раствором хлористого нат.рия и боратным. буфером . Ферментативную активность препарата определяют на 2%-ном растворе казеина с рН 8,0 при . Активность препарата трипсина, полученного на регенерированном нос теле равняется 9,0 Е/г, выход актив ности 11,0%. Операционную стабильность препар та трипсина оценивают по остаточной активности при проведении промывки препарата 2%-ным раствором казеина с рН 8,0 в колонке в течение 20 ч со скоростью протекания казеина 0,2 мл/мин при 20С. После такой пр мывки сохраняется 81% от исходной активности. Активность препарата трипсина, п лученного связыванием фермента на носителе, изготовленного на основе силохрома покрытого эпоксидной смол отвержденного полиэтиленполиамином и активированного бромцианом (перви ный ферментный препарат на данном н сителе) , равняется 12,0 Е/г, выход активности Т,6% и после промывки 2%-ным раствором казеина сохраняетс 69,0% от исходной активности. Пример 2. 5г инактивироаанного ферментного препарата на основе сипихрома, покрытого эпоксидной смолой, сначала кипятят в 18 нп 0,6%-ного раствора брома в четыреххлористом углероде в течение 0 мин, как в примере 1, а затем обрабатывают 0, %-ным раствором цианистого калия в этиловом спирте, как в примере 1. Содержание активных групп в регенерированном носителе 47-50 мк-экв/г, 10 г регенерированного носителя смачивают 25 мл раствора панкреатина (60 мг/мл) в буфере с рН 8,0. Реакцию иммобилизации проводят при в течение 20 ч. После инкубации препарат промывают последовательно боратным буфером с рН 8,0, 1 м раствором хлористого натрия и боратным буфером. Ферментативную активность препарата определяют на 2%-ном растворе казеина с рН 8,0 при . Активность препарата пайкреатина равняется ,8 Е/г, выход активности k%. После промывки 2%-ным раствором казеина сохраняется 9,7% от исходной активности. После инактивации ферментного препарата 5 г материала повторно обрат батывают бромом и цианидом калия. Иммобилизацию панкреатина проводят вышеописанным способом. Активность препарата панкреатина равняется 37,2 Е/г, выход активности . После промывки 2%-ным раствором казеина сохранялось 3,5% от исходной ак1 йвности. Активность препарата панкреатина, полученного связыванием фермента на носителе, изготовленного.на основе силохрома, покрытого эпоксидной смолой, отвержденной полиэтиленполиамином и активированного бромцианом (первичный ферментный препарат на дан ном носителе), равняется 37,6 Е/г, выход активности 17,7% и после промывки 2%-ным раствором казеина сохранялось 5,2% от исходной активности. Таким образом, предлагаемый способ позволяет регенерировать различные активные группы на органоминеральных носителях с инактивированным ферментным препаратом, что обеспечивает получение высокоактивных и стабильных иммобилизованных ферментных препаратов на основе органоминеральных носителей. Формула изобретения Способ регенерации носителей для иммобилизации ферментов путем обработки носителей раствором реагента, отличающийся тем, что, с целью увеличения количества активных групп на носителе для получения высокоактивных и стабильных иммобилизованных фермент- Ю 9369 7 ных препаратов на основе органоминеральных носителей, последние сначала кипятят в растворе брома в четыреххлористом углероде, а затем обрабатывают раствором цианистого калия в этиловом спирте. Источники информации, принятые во внимание гфи экспертизе 1. Патент Великобритании ff 1365886, кл. С 07 G 7/02, 197 (прототип).