Способ получения активированных носителей Советский патент 1981 года по МПК C07G7/02 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВИРОВАННЫХ НОСИТЕЛЕЙ

Изобретение относится к.способу получения активированных йодонерастворимых носителей для иммобилизации белков. Иммобилизованные на таких сорбентах ферменты могут быть применены как химические реактивы и йро- мьшшенные катализаторы длят прОВёде- ния ферментативных реакций в химической, фармацевтической и пищевой отраслях промышленности. Иммобилизация ферментов путем их присоединения к нерастворимым НО Сйтелям.является одним из наиболее известных способ улучшения технологических показателей этих биокатализаторов. Метод иммобилизации ферментов заключается в-присоединении их к активированным нрсите;пям, причем сво ства получаемых катализаторов во мно гом зависят от способа получения и активации носителя. В качестве, носителей часто используют органомине- ральные материалы, в частности, покрытые полимерами пористые кремне- земные материалы. Носители такого типа характеризуются Хбреминй гидродинамическими свойствами и достаточной стабильностью получаемых препа- ратов,. свойства которых во многом- зависят от метода внесения и активаций полимерного слоя на носителе. Известен способ получения модифицированных твердых носителей путем покрытия поверхности носителя полимером, в качестве которого исполь-ззтот полиакроттейн р. Слой полимера образуется на поверхности носителя в результате пропитывания носителя мономером, содержащим свободные альдегидные группировки. Полимеризация происходит на поверхности носителя. Иммобилизация фермента производится по реатсцйи между альдегидными группами носителя и,аминогруппами фермента. Такой способ позволяет получить иммобилизованные на органоминеральных носителях ферменты, однако он

Ограничивает модификацию носителя только альде идсодёржгащидаГ полимерами. Свяэьшание ферментов через альде.гиды не всегда позволяет получить активнь1е препараты. Кроме того, получаемые лин ейные полимеры обладают значительной раствортимостью и не скрепляют неорганическую структуру носителя.

Известен также способ получения активиройанного твердого носителя, пригодного для приготовления водонерастворимых ферментных перпаратов. На поверхности носителя в результате полимеризации образуется слой полимера 2, в качестве которого используют полиакролеин. Носитель (фарфор, измельченное стекло) пропитывают мономером, содержаашм свободные альдегидные группировки. Полимеризация происходит на поверхности носителя.

В результате модификйции носителя таким способом получают носитель со свободными альдегидными группами. Иммобилизация фермента (трипсина, папаина) производится чер1ез реакцию альдегидных групп носителя е аминогруппами фермента.

Недостатком этого способа является малая операционная стабильнбс ь получаемых активированных йосйтелей. Покрытие неорганического материала линейными полимерами, образуюпщмйся при полимеризации виниЛыйпс полимеров, не обеспечивает доСтаточйую нерастворимость и, ёйёдовательно, стабильность получаеиъкферментнь1х препаратов. Такой способ Oihpaнигчива ет модификацию носителя только альдегидсодержащими полимерами, а связывание ферментов через альдегидные группы не всегда Дает возможност получить активные препараты. Кроме того, способ не обеспечивает высокого содержания белка на едииицу носителя. При иммобилизации трипсина достигается связыванием 0,2 мг белка на 1 мл носителя.

Цель изобретения - повышение операционной етабильности носителей для иммобилизации биоактивных веществ.Это достига1ется известщ.1м способо пдлучёнйй актйвйрО ваннь1Х носителей для иммобилизации белков путем покрытия пористого неорганического gaтериала с диаметром пор 200-2000 А

пленкообразующим веществом, в ка-чёстве которого используют эпоксидную смолу И отверждают ее на носителе полиэтиленполиамином или 1,6-гексаметилендиамином в соотношении эквивалентов эпоксидной смолы и амина 1:0,25 при 100-120°С в течение не менее 1ч.

Способ осутцествляют следующим образом. 5 вес. ч. силохрома или силикагеля смачивают 9 вес. ч. 1,7% эпоксидной смолы в ацетоне. После выпаривания растворителя при 100С проводят затвердение полиэтиленполиамином или 1,6-гексаметиллендиамином посредством кипячения в их водных растворах ВТ течение I ч (соотношение, эквивалентов эпоксидной смолы и амина 1:0,25). Носитель фильтруют, промывают водой и высушивают в термостате при . Получают носитель, содержащий на поверхности пор пленку С активными эпоксидными группами, способными к непосредственному присоединению биоактивных и еще с тв.

При таком способе можно провести

полимеризацию при повышенной температуре, :способствуя этим образованию поперечных связей между молекулами полимера, а также связей между полимером и йОверхностью носителя. Образование в порах носителя полимерной пленки закрепляет структуру носител:я, уменьшает нежелательное адсорбционное воздействие молекул фермента с носителем, и предотвращает вымывание фермента с носителя из-за растворимости кремнезема при рН 7 и выше. .

Пример 1, Получение носителя, активированного эпоксидной смолой с последующим затвердением полиэтиленполиамином.

Для получения носителя проводят пропитывание кремнеземного материала раствором ЭПОКСИДНОЙ смолы и затем затвердение водным раствором полиэтиленполиамина, который берется в количестве 25% от эквивалентного количества эпоксидной смолы.

5 г силохрома или силикагеля смачивают 9 мл раствора 1,7% эпоксидной смолы в ацетоне. После вьтаривания растворителя при 100°С проводят затвердение 15 мл водным раствором прл1{этиленполиамина кипячением при lOO-c в течение 1 ч. Затем

носитель фильтруют, промьшают водой и высушивают в терйЬстатё при 100° С..

Способность используемой эпоксидной смолы к привязыванию амина составляет 2500 мк экв./г (определена кипячением смеси смолы с избытком амина при в течение 1ч и обратным титрованием непрореагировавшего амина кислотой). 5 г носителя покрывается 0,153 г (90,017) смолы, способность к привязыванию амина которой составляет 383мкэкв/г. (о,1532500), и необходимое количество полиэтиленполиамина, содержащееся в 15 мл раствора, составляет 7,2 мл (0,25383-75).

Получают активированный носитель, содержащий на поверхности эпоксидные группы в количестве 65 мк экв на i г носителя (определено по способу, описанному в данном примере).

Пример 2. Получение носителя, активированного эпоксидной смолой с последуницим затверденией 1,6-гексаметилендиамином.

Для получения носителя проводят пропитывание кремнезёййого материала раствором эпоксидной смолы и зачтем затвердение водным раствором 1,6-гексаметллендиамина, который берется в количестве 25% от эквивалентното количества эпоксидной смолы.

5 г силохрома Или силикагёля смачивают 9 мл раствора 1,7% эпоксидной смолы в ацетоне. После вьтаривания растворителя при проводят затвердение 15 мл водным раствором I,6-гексаметилендиамина кипячением при в течение 1 ч. Затем носитель фильтруют, промывают водой и высушивают в термостате при 100 С.

При использовании эпоксидной смолы со способностью к привязьтанию амина 2500 мк экв/г необходимое количество 1,6-гексаметилендиамина, содержащееся в 15 мл раствора, составляет 5,6 мг (0,25-383 58).

Получают активированный носитель, содержащий на поверхности эпкосидные группы в количестве 50 мк экв на 1 г носителя.

Пример 3. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, акФивированного эпоксидной смолой с последующим затвердением полиэтиленполиамИном.

5 г активированного эпоксидной смолой носителя (пример О смачивают 8 мл боратным буфером с рН 8,0. Смесь педемешивают и вакуумируют 15 мин для удаления воздуха из пор. Затем добавляют 5 мл раствора химотрипсина с концентрацией 40 мг/мл в боратном буфере с рН 8,0, перемешивают и выдерживают при в течение 2 ч. После инкубации препарат промывают в воронке Бюхнера боратным буфером рН 8,0, 1 М раствором хлористого и затем еще боратным буфером, добавляя эти растворы порциями. Объем промывных вод состаляет 100 мл. Полученный иммобилизованный препарат хранят в боратном буфере в холодильнике.

Ферментативную активность пре-. парата определяли на 2% раствора казеина. Активность равнялась 39,7 Е/г. Стабильность препарата оценивали по остаточной активности после проведения промьшки препарата 100 мл 2%-ным раствором казеина рН 8,О в колонке с диаметром 6 мм и высотой столба препарата 70 мм в течение 24 ч. После такой промывки сохранялось 29% от исходной активности.

Пример 4. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием йосителя, активированного эпоксйдной смолой с последующим затвердением 1,6-гексамет,иледиамином.

5 г активированного эпоксидной смолой носителя (пример 2) смачивают 8 МП боратным буфером с рН 8,0. Смесь перемешивают и вакуумируют 15 мин для удаления воздуха из пор. Иммобилизацию фермента проводят как описано в прийерё 3. Получают препа химотрипсина с активностью на 2% каина 36,7 Е/г. После промывки препарата 2%-ным раствором Казеина сохранялось 20% исходной активности.

Йредлагаемый способ позволяет получать носители для иммобилизации биоактивных веществ с повышенной операционной стабильностью, в которых внутренняя поверхность пор покрыта слоем нерастворимого полимера содержащего эпоксидные группы, дающие возможность иммобилизации ферментов в укрупненнолабораторном масштабе, в том числе и ферментов, нуждающихся в высоких значениях рН. . 7 Такой способ дает возможность получить препараты XHMOtpHnaHHa, сохраняющие активность при 4С в течение 1-2 месяцев, что является предпосьшкой для достижения высокой операционной стабильности препара овТ Данный способ позволяет по срав.нетшю с известным способом связыва ть в Т0-2б раз больше белка на единицу носителя, Формула изобретения .Способ получения активированных нЬсителей для иммобилизации белков путем пропитки пористого неорганического материала органическим пленкообразующим вёществом, содёржащим реакционноспособные группы, . . . - -- : 8 отличаю; щийся тем, что, с целью повышения оп ерационной стабильности получаемых материалов, при покрытии пористого неорганического материала с диаметром пор 200-2000 А в качестве пленкообразующего вещества используют эпоксидную смолу и отверждают ее на носителе по иэтиленполиамином или 1,6-гекс.аметилендиамином в соотношении эквивалентов эпоксидной смолы и амина 1:0,25 при 100-120 0 в течение не менее 1ч. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1, Патент № 2229298, кл. С 07 G 7/02, опублик. 1974. 2. Патент Великобритании № 1342186, кл. С 08 Н 1/02, опублик. 1973 (прототип).