Способ получения носителя для иммобилизации биологически активных веществ Советский патент 1980 года по МПК C07G7/02 C07F7/02 

Изобретение относится к химическо и микробиологической промышленности и может быть использовано для получе ния активированных носителей для иммобилизации биологически активных веществ, в частности ферментов. Полу ченные на их основе иммобилизованные биологически активные вещества могут быть применены как лекарственные препараты, биохимические реактивь и как новый тип промышленных катализаторов - биокатализаторы. Иммобилизация ферментов путем их присоединения к нерастворимым носителям является хорошо известным спо,собом улучшения технологических пока зателей этих биокатализаторов. Из большого числа материалов самыми распространенными носителями являются неорганические кремнесодер жащиё пористые вещества: преимущест венно пористое стекло, силохром, силикагель и керамические материалы Указанные носители часто покрывают полимерной пленкой, содержащей реак ционноспособные группы, с последующей активацией носителя бифункциональным реагентом, ковалентно связывающйм иммобилизуемый фермент с носителем. Носители такого типа характеризуются хорошими гидродинамическими свойствами и стабильностью вследствие упрочения структуры носителя. Известен способ получения носителя для иммобилизации биологически активных веществ путем обработки кремнеземного носителя раствором полимера (поликарбамида, полиметакрилата, найлона). Активацию покрытого полимерной пленкой носителей проводили кипячением с гидразингиДратом с последующим переводом в диизоцнанаты через амиды кислот ll. Однако полученные таким образом носители не обеспечивают стабильности, достаточной для применения полученных на их основе илв билизованных ферментов в промышленн12Х процессах. Наиболее близким по технической сущности является способ получения носителя для иммобилизации белков путем обработки Пористого неорганического материала органическим пленкообразующим веществом с последующей активацией носителя глутаровым диальдегидом, дииэоцианатом или п-бен зохиноном 2J. По данному способу неорганический пористый материал (с лохром, силикагель) обрабатывают см сью адипиновой кислоты и 1,6-гексаметилеидиамина в соотношении эквивалентов соответственно 1:1,5 и осу ществляют поликонденсацию полимера при 180-200°С в атмосфере инертного газа. , Затем носитель промывают водой и ацетоном и сушат при . Получаю носитель с содержанием активных ами ногрупп в Количестве 50 мкв/г носителя. .-- - --..;.--:-.-- - .: Недостатками указанного способа является сравнительно невысокая реакцирнноспрсобность и недостаточная высокая стабильность в процессе использования получаемого носителя, обусловлейная природой полимера. Целью изобретения является улучшение качества носителя, т.е. повышение реакционноспрсобности носител и стабильности в процессе использова:ния. Указанная цель достигается тем, что в качестве пленкообразующего ве щества применяют Диизоцианат адипиновой кислоты, аобработку неоргани ческого материала осуществляют после довательно диизоцианатом адипиновой кислоты при 105-115°С и 1,6-гексаметиландиамином/при температуре кипе ния резекционной смеси при молярном соотношении эквивалентов диизоцианат 1,б-гексаметилендиамин 1: (1,5-2) с высушиванием после каждой обработки при lOO-iao C в течение 1,5-2 ч. Согла9но„изобретению описывается способ получения носителя для иммоби лизации биологически активных вещест в частности, ферментов, путем обработки пористого неорганического материала органическим пленкообразующим веществом, представляющим собой 6-членное циклическое насыщенное соединение, и 1,6-гексаметилендиамином с последугачей.активацией носителя реагентом, выбранным из группы, включающей глутаровый диальдегид, диизоцианат адипийоэойили винной кислоты, с высокой реакционноспособностью и стабильностью в процессе использования, заключающийся в том, что неорганический материал обрабаты вают последовательно диизоцианатом .адициновой кислоты при 105-115 с и 1,б-гексаметилендиамином при температуре кипения реакц;ионной смеси при молярном соотношений эк вивалентов диизоцианат: 1,б-Гексйметйлёндиамин 1:(1,5-2), с высушиванием после каждой обработки при 100-120 С в течение 1,5-2 ч. Предпочтительно процесс проводят следующим образом. С целью увеличения количества 1 ейкционнопособных гидроксильных групп 474 на поверхности неорганичес| их пористых материалов (кремнеземов) последние обрабатывают растворами NaOH и НС1 и высушивают до постоянного веса. Затем носитель обрабатывают раствором диизоцианата адипиновой кислоты в толуоле при нагревании до 11012 С в течение 1,5-2 ч с последующим высушиванием при 100-120 С и водным раствором 1,6-гексаметилендиамина при кипячении в течение 15 мин с последующим высушиванием при 120С. В результате обработки получают носитель- с содержанием активных аминогрупп в количестве 100 мк экв/г носителя, который далее активируют глутаровым диальдегидом или диизоцианатом адиппиновой или винной кислоты. Полученный носитель пригоден для иммобилизации биологических активных веществ, например/ ферментов. Синтезированная на поверхности неорганического пористого материала поликарбамидная пленка по своей природе обладает улучшенными свойствами - повышенной стойкостью к дейстВИЮ воды и минеральных кислот, к действию различных атмосферных воздействий. При нагревании между молекулами поликарбамида образуются дополнительные поперечные связи, что способствует образованию равномерной полимерной пленки, а также укреплению связи полимера с поверхностью носителя, Это обусловливает повышенную стабильность получаемого носителя в процессе его использования. Пример 1. К5г силохрома или силикагеля добавляют 10 мл 0,1 н раствора едкого натриЯ. Пропитанный щелочью силохром высушивают при . После этого материал промывают 10 мл 0,15 н соляной кислоты и высушивают при . Обработанный таким путем носитель пропитывают 7 мл 0,25 н раствора диизоциа 1ата адипиновой кислоты в толуоле. Смесь выдерживают при в течение 1,5 ч. После этого материал высушивают при . Затем носитель кипятят в 0,4 н водном растворе 1, б-гексаметилендиаг-шна в течение 1 ч. Затем носитель фильтруют, промывают водой и ацетоном и высушивают при 12 . В результате такой обработки получают носитель, содержшдий на поверхности активные аминогруппы в количестве 100 мк экв на 1 г носителя. Пример 2. 5 г обработанного растворами едкого натрия и соляной кислоты (пример 1) носителя пропитывают 7 мл 0, 3 н раствора диизоцианата адипиновой кислоты в толуоле. Смесь выдерживают при 110°С в течение 45 мин. После этого материал высушивают при . Затем носитель кипятят в 0,6 н .водном растворе 1,6-гек саметиленлиамина в 15 мин. Затем носитель фильтруют, промывают водой и ацетоном и высушивают при 120°С. В результате такой обработки получают носитель, содержащий на поверхности активные аминогруппы в количестве ЮОмк, экв на 1 г носителя. Носитель, полученный по примерам 1 и 2, используют для иммобилизации ферментов с помощью бифункциональны реагентов, таких как глутаровый диальдегид, диизоцианат адипиновой ил винной кислоты. Пример 3. Получение нераст римого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного полйка рбамидом, активированием глутаровым диальдегидом. К 5 г модифицированного поликарбамидом носителя (пример 1) добавля ют 15 мл 2 -ного водного раствора глутарового диальдегида. Смесь перемешивают и выдерживают при комнат ной температуре в течение 2 часов. После этого материал отмйвается Дис тиллированной водой от непрореагировавшего глутарового диальдегида на воронке Бюхнера до исчезновения глутарового диальдегида в проглывной воде и к влажному носителю добавляю 5 мл раствора хиМотрипсина с Концентрацией 50 мг/мл в боратном буфе ре рН 8,0. Смесь перемешивают, ва-. куумируют для удаления йоздуха из пор и выдерживают при в течени .-4 ч. После инкубации препарат промывают в воронке Бюхнера боратным буфером рН 8,0, 1 М раствором хлори того натрия и затем еще боратным буфером, добавляя эти растворы порциями. Объем промывных вод составля ет 100 мл. Полученный иммобилизован ный препарат хранят во влажном виде в боратном буфере в холодильнике. Ферментативную активность препарата определяют на синтетическом субстрате - этиловом эфире ацетилти розина (АТЭЭ) . Активность равняется 1550 Е/г (сохраняется 50% от исходной активности) содержание белка 17,4 мг/г. Стабильность препарата оценивают по остаточной активности после проведения промьгвки препарата 100 мл 2%-ным раствором казеина рН 8,0 в колонке с диаметром 6 гдм и высотой столба препарата 70 мм в те чение 24 ч. После промывки сохраняется 70% от исходной активности. Пример 4. Получение нераст воримого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного поликарбамидом, активированием диизоцианатом адипиновой кис лоты. К 5 г модифицированного поликарбамидом носителя (пример 1) добавляют 20 мл 0,25 н раствора дииэоцианата адипиновой кислоты в толуоле и смесь кипятят при в течение 1ч. После этого носитель фильтруют, промывают ацетоном и высушивают при . Вследствие такой обработки получают носитель с активными изоцианатными группами (80 мк,экв/г). Такой носитель смачивают 8 мл бо- . ратного буфера. Иммобилизацию фермента проводят Как описано в примере 2. При иммобилизации панкреатина получают препарат с активностью 1100 Е/г (на АТЭЭ) (сохраняется 42% от исходной активности) с содержанием белка 17,8 мг/г. Для определения стабильности препарата проводят гидролиз 2% раствора казеина в реакторе перемешивания при в течение 17 ч. После такого гидролиза остаточная активность составляет 44% от исходной. Пример 5. Получение нерастворийого ферментного препарата с исползованием носителя, модифицированного поликарбамидом, активированием диизоцианатом адипиновой кислоты. 5 г модифицированного поликарбамидом носителя (пример 1) обрабатывают раствором диизоцианата адипиновбй кислоты, как в примере 3. Активированный носитель содержит 100,0 мк экв активных изоцианатных Групп на г) смачивают 8 мл боратного буфера. Иммобилизацию химотрипсина проводят, как описано в примере 2. .Получают препарат с активностью АТЭЭ 1840 Е/г (сохраняется 49% от исходной активности) с содержанием белка 18,2 мг/г. После промывки препарата 2%-ным раствором казеина остаточная активность составляет 57% от исходной. Пример 6. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, модифициро- . ванного поликарбамидом, активированием диизоцианатом винной кислоты. К 5 г модифицированного поликарбамидоМ носителя (пример 1) добавля1Ьт 20 мл 0,01 н водного раствора диизоцианат винной кислоты, рН которого непосредственно перед использованием вакуумируют и контактиРУ1ЭТ в течение 1 часа. После этого носитель фильтру1от и прО1иивают боратным буфером. Иммобилизацию химитрипсина на влажном носителе проводят, как опйсайо в примере 2. Получают препарат с активностью 1670 Е/г (на ТАЭЭ) и содержанием белка 24,7 мг/г. Выход иммобилизации по активности составляет 44% После промывки препарата 2% раствором казеина остаточная активность составляет 58% от исходной. Пример 7, Получение нерастворимого ферментного препарата с

использованием носителя, модифицированного поликарбамидом, активированием рлутаровым диальдегидом.

10 МП раствора |&-галактозидазы в 0,2 М ацетатйом буфере с рН 4,2 контактируют с О,24 МП 25%-ого раствора глутарового диапьдегйда при комнатной Т5 мпературе в течение 16 минут. После этого полученный раствор пропускают при помрвда перистальтического насоса через 1 г модифицирован:.юго поликарбамидом носителя (пример 1), загруженного в термостатируемую KojioHKy. Иммобилизацию проводят при в течение 2,5 ч. После этого остаточный раствор отделяют от носителя и препарат проивлвают 100 мп ацетатного буфера с рН 4,2, 50 мл 0,5 М раствора хлористого натрия и затем 100 мл ацетатного буфера.

Полученный иммобилизованный препарат |Ь -галактозидазы количественно вымывают из колонки, отжимают и определяют его активность по начальной скорости расщепления о-нитрофенил-й- Р-галактопиранозида. Активность препарата составляет 187 Е/г, содержание белкз в препарате 40 мг/г и йыход им Ioбилизaции по актийности 40%. Время полураспада активности препарата при гидролизе 5% раствора лактозы в термостатируемой колонке при 60°С равняется 30 дням.

Формула изобретения

Способ получения носителя для иммобилизации биологически активных

8

веществ путем обработки пористого неорганического ма.териала органическим пленкообразующим веществом, представляющим собой б-членнре циклическое насыщенное соединение, и . 1,б-гексаметилендиси мном с последующей активацией носителя реагентом, выбранным из группы, включающей глутаровый диальдегид, диизоцианат адипиновой или винной кислоты, о т ли ч ающи и с я тем, что, с целью улучшения качества носителя, в качестве органического пленкообразующего вещества используют диизоцианат адипиновой кислоты и обработку неорганического материала осуществляют последовательно диизоцианатом адипиновой кислоты при lOS-llS C и 1,6-гексаметилендиамином при температуре кипения реакционной смеси при молярном соотношении эквивалентов диизоцианат 1,6-гексаметилендиамин 1:(1,5-2) с высушиванием после каходой обработки при100-120 С в течение 1,5-2 часов.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Киппер Р.Х., Эрин А.Э., Егоров Х.Я., Кивисилла К.А., Кестнер А. Получение активированных носителей для иммобилизации ферментов. Труды Таллинского политехнического института, 1976, №402, с. 21-28.

2.Авторское свидетельство СССР по заявке 2506847/04,

кл. С 07G 7/02, С.07 F 7/02, . 18.07.77 (прототип).