Способ получения циклического дисульфида метилового эфира N-трет-бутилоксикарбонил-L-цистеинил-L-цистеина Советский патент 1982 года по МПК C07K5/62 

Изобретение относится к способу получения цистеинсодержащего пептида циклического дисульфида метилового эфира N-трет-бутилоксикарбонил-L-цистеинил-Ь-цистеина формулы

«:Н5)з 0 5в Н-СН-СОКН-СН-СООСНз

СН2 . S1

который используется в качестве промежуточного продукта в синтезе пептидных гормонов - окситоцина, вазопрессина и инсулина.

Известен способ получения циклического дисульфида метилового эфира N-трет-бутилоксикарбонил-Ь-цистеинилL-цистеина исходя из гидрохлорида S-ацетамидометил (Аст)-Ь-дистеина 1 Последний получаютпутем алкилирования гидрохлорида L-цистеина N-оксиметилацетамидом в 6 н. НС1 в атмосфере азота с выходом 52% 2. Необходимее для синтеза производные S-Аст- -L-цистеина получают следующим путем: этерификацией гидрохлорида S-Аст-L- -цистеина в метаноле в присутствии хлористого тионила получают гидрохлорид метилового эфира S-Acm-L-цистеина с выходом 98%, а ацилированием

гидрохлорида S-Acm-L-цистеина Вос-азидом получают Boc-S-Acm-L-цистеин с выходом 52%.Конденсацией Boc-S-Acm-L-цистеина с гидрохлоридом метилового эфира S-Аст-L-цистеина карбодиимидным методом получают соответствующий ципептид - метиловый эфир Boc-S-Acm-L-циcтeинил-S-Acm-L-циcтeинa с выходом 78% Циклический дисульфид по10лучается путем отщепления S-защитных групп с одновременным образованием дисульфидного цикла действием иода в метаноле.

Общий выход целевого продукта 15 17,4%,считая на исходный гидрохлорид цистеина. Это обусловлено низкими выходами получения производных S-Аст-L-цистеина из-за протекания побочных реакций. Кроме того, потеря

20 продуктов возникает при выделении и очистке производных S-Аст-L-цистеина из-за одинаковой растворимости исходных и конечных продуктов в воде и органических растворителях.

25

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения циклического дисульфида метилового эфира N-TPBT -бyтилoкcикapбoнил-L-циcтeинил-L-цистеина, основанный на использо30вании в качестве исходного соединения гидрохлорида S-бензамидометил (Bzm)L-цистеина. Этот способ включает сле дующие стадии: введение SH-защитной группы в гидрохлорид циотеина путем апкилирования гидрохло жда L-цистеина N-оксиметилбензамидом, ацилирование гидрохлорида .-Вгт-Ь-цистеина Вос-аэидом, конденс йю полученного N-грег-бутилоксикарбонил-S-Bzm-цисте ина с метиловым эфиром S-Bzm-L-цистеина, полученным этерификацией гидрохлорвща S-Bzm-1г-цистеина метанолом в присутствии тионилхлорида карбодиимидным методом и полученный метиловый эфир N-трет-бутилоксикарбонил-S-Bzm-L-циcтeинил-S-Bzm-циcтeинaобрабатывают иодом в метаноле для одновременного отщепления S-Bzm-saщитных групп и образования дисульфид ного цикла. Общий выход конечного продукта 22% 3. Однако известный способ имеет низ кий выход целевого продукта, связанный с недостаточной устойчивостью производных S-Bzm-цистеина к основаниям, применяемым в синтезе пептидов неполным отщеплением S-Вгт-заадитной группы иодом в метаноле, недостаточно высокими выходами на стадиях ацилирования и конденсации.

Й«1, MBj-CM-tOOH

ralpoxfofuf uufтеина н м IS7.S2

(S оксинегпмлпирр HCl-UHj-CH-COflM

Гивре мрав нистеина, пм 254.74

(CHjfteOj Ix VoOH

imptmSymuAnupo тарбонот

(eHjIjtOW-NH-CH-tOW CHt

I 4-C(lj

Bec-S-Pym цистеина

H.M Jie,39MM 268,76

L neiioi снешанмы anta)fuM I

«H|),o «-NH- H- :e-iiH-«H-eoo(H

Qll-CH.-iS-CHi-/

HtmaMlbiu Soe-i-ftjm-lrvuemeairuii-t-fijn-lM-itafireitMa M.M 5}.ee

I 1г/м«ои

«H,|,tOC«-NH- R- «-NH-CH-(On(H (

i1

ttuiiiuveeiniH внсуль ив Htmufotne tvufa Вас-1,-чие/пеиMUit-L - ttuemeaner, /rjv 938,43

tHt-SM Htl.

HO-tHj - Hj- Q

п

HeOH.ietLz

iHH.WIj-Cll-tOOC

bij

-:3

S-tHiD

Г гЗ/кклорав Htfa i4 Цель изобретения - повышение выхода целевого тродукта. Поставленная цель достигается тем, «то способ получения циклического дисульфида метилового эфира N-TPCT-бутилоксикарбонил-Ь-цистеинил-ь-цистеина основан иа последовательном введении 8Н-защитной группы в гидрозагорид Ь-цистеина путем алкилирования N-оксиметилпиррсяидоном, ацилировании полученного гидрохлорида S-пирролидонимидо1 ютил (Рут) - L-цистеина ди-трет-бутилпирокарбонатом, конденсации Ы-трет -бутнлоксикарбонил-S-Pym-Ij-цистеина с метиловым эфиром S-Pyin-L-цистеина, полученнш этерификацией гидрохлорида S-Pym-L-цистеина метанолом в присутствии тионилхлорида, методом смешанных ангидридов с использованием изобутилхлорформиата и обработке полученного метилового эфира N-трет -бутилоксикарбонил- S-Pyra-Ii-ци ст еинил- S-Pym-L-ци стеина йодом в метаноле. Получение циклического дисульфида метиловогчэ эфира Вос-цистеинил|-цистеина осуществляют по следующей схеме: При м е р. Получение циклического дисульфида Н-трет -бутилоксикар бонил-Ь-цистеинил-Ь-цистеина. Гидрохлорид 5-пирролидонметил-ь-цистеина I. К смеси 15,7 г(0,1 моль) гидрохпоркдл Ь-цистеина, 12,7 г (0,11 моль) N-оксиметилпирролидона и 40 мл вацы, охлажденной до 0°С, добавляют при перемешивании 15 мл концентрированной соляной кислоты и перемешивают при комнатной темпер туре 30 мин. Образовавшийся раствор выливают в смесь 450 мл изопропилового спирта и эфира (1:2), перемеши вают до начала кристаллизации и реа ционную смесь оставляют в холодильнике на 4 ч. Продукт отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и перекристаллизовывают из смеси мета нола и эфира. Выход гидрохлорида I 22,95 г (90%, считая на гидрохлорид цистеина) . Т.пл. 174-175°С + +4,7(с1, HijiO) , ti3g-13,4 (с1,МеОН) . Найдено, %: С 37,70; Н 5,92; N 10,94 CgHi4NaOaS-Hci Вычислено, %: С 37,7-2; Н 5,94; N 11,00. Гидрохлорид метилового эфира S-пирролидонметил-Ь-цистеина II. К 48 мл метанола, охлажденного до-15С, при интенсивном перемешива нии прикапывают 2,2 мл хлористого тионила, затем добавляют 6 г (0,024 моль) гидрохлорнда S-пирроли донметил-Ь-цистеина I и полученный раствор перемешивают прк 4 ч, после чего растворитель отгоняют в вакууме досуха. Остаток перекристал лизовывают из смеси метанола и эфира и сушат в вакуум-эксикаторе над едким кали. Получают 6,27 г 11(99,6 считая на I). Т.пл. 70-720с, ,2 (с1, МеОН).° Найдено, %: С 40,17; Н 6,25; N 10,37 Cg lfeN-Pb SHCl Вычислено, %: С 40,22; Н 6,38; N 10,42. N-трет-бутилоксикарбонил-S-пирро лидонметил-Ь-цистеин III. 10,2 г(О,04 моль) гидрохлорида 5-пирролидонметил-Ь-цистеина I растворяют при перемешивании в 80 м 1 Н. раствора едкого натра и приливают раствор 12 г (0,055 моль) ди-трет-бутилпирокарбоната в 40 мл тре -бутилоЕОГр спирта. Раствор нагрев ют при в течение 5 мин, а затем пероиюшивают при комнатной температуре 2,5 ч. Затем реакционную смесь экстрагируют 50 мл петролейно го эфира, водный слой охлгикдают до и подкисляют до рН 3-4 лимонно кислотой. Подкисленную реакционную массу насыщают хлористым натрием (/-20 г) и экстрагируют этилацетатом (3x50 мл). Этилацетатиые вытяжки промывают насыщенным раствором хлористого натрия и затем сушат над безводным сернокислым натрием. Этилацетатный раствор упаривают в вакууме и к остатку добавляют гексан. Продукт пёрекристёшлизовывают из смеси этилацетата и гексана. Выход 12,5 г(98%, считая на I). Т.пл. 113114 С, - 28,3 (с 0,5, ) Найдено, %: С 49,10; Н 6,97|Ы 8,72 Вычислено, %: С 49,04; Н 6,97.; N8,80. Метиловый эфир N-трвт-бутилокеякарбонил-5-пиррапидонметил-Ь-цистеинил-З-пирролидонметил-Ь-цистеина IV. К охлажденному до (-15)-(-20)0 раствору 1,27 г(4 ммоль)Ы-трет-бутилоксикарбонил-5-пирропидонметил-Ь-цистеина в 5 мл диметилформамида прикапывают при перемешивании 0,44 мл (4 ммоль) N-метилморфолина и затем 0,52 мл (4 ммоль) изобутилового эфира хлоругольной кислоты. Через 10 мин добавляют охлажденную смесь 1,075 г (4 ммоль) гидрохлорида метилового эфира 8-пирролидонметил-Ь-цистеина и 0,44 мл(4 ммоль) N-метилморфолина в 5 МП диметилформамида и перемешивают еще 3,5 ч-при (-15)-(-20)0. После завершения реакции смесь разбавляют и экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты. Органический слой промывают последовательно 0,25 Н. раствором бикарбоната натрия, 0,05 Н. серной кислотой и насыщенным раствором хлористого натрия и сушат над безводным сульфатом натрия. Растворитель упаривают в вакууме и к остатку добавляют гексан. Полученный продукт перекристаллизовывают из смеси этилового эфира уксусной кислоты и гексана. Выход 1,92 г (90%), т.пл. 78-80«С, oL)°- 47,8 (с 0,1, МеОН). Найдено, %: С 49,54; Н 6,94; N 10,41 С1Ч. Вычислено, %: С 49,61; Н 6,81; N 10,52. Циклический дисулТьфид метилового эфира N-TPST -бутилоксикарбонил-Lцистеннил-Ь-цистеина V. К раствору 1,27 г(5 ммоль) иода в 50 МП метанола прикапывают в течение 30 мин раствор 0,67 г(1,25 ммоль) метилового эфира Boc-S-пирролидонметил-ь-цистеинил-5-пирролидонметил-L-цистеина в 30 мл метанола,после чего смесь перемешивгиот еще 40 мин. После охлаждения до 0°С добавляют 1 Н.раствор тиосернокислого натрия до слабо-желтой окраски, смесь упаривают до 10 мл, разбавляют хлороформом, промывают 0,5 н. раствором тиосернокислого натрия и водой, высушивают над безводным сульфатом натрия. Раство1жтель упаривают, остато выкристаллизовывают при добавлении петролейного эфира. Выход гГбсйё. перекристаллизации из смеси хлороформа и петролейного эфира 0,39 г(92%, считая на IV). Т. пл. 165-1ВТ°С, 67,8 (с1, МеОН) . Общий выход 73%Тна 1 идрохло 1д цистеина). Найдено, %: С 42,97; Н б,04Гы 8, Вычислено, %: С 42,89; Н 5,99; N 8,33. Т. пл. 185-187С, 65 (с. 1,87, МеОН)1. Т. пл. 185-187 64,5 (с. 1,87, МеОН)3. Как видно из приведенного пример предлагаелый спосрб позволяет повысить выход конечного продукта до 73 Высокий общий выход целевого про дукта обусловлен высокими выходами на всех промежуточных стадиях в син тезе. При алкилировании гидрохлорида цистеина с N-оксиметилпирролидоном получают новое производное цистеина гидрохлорид-8-пирролидонметил(Pyra)-цистеина.Преимуществом гидрохлорида S-Рут-L-цистеина является его хо|юшая кристаллизуемость, высокий вы ход получения, устойчивость к воздей ствию различных реагентов, применявмых в синтезе пептидов (действие кислот, едких щелочей, триэтиламина, аммиака гидразингидрата), легкость и селективность отщепления S-защитной группы иодом в метаноле. Использование ди-трет-бутилпирокарбоната позволяет повысить выход на стадии ацилирования до 98%, а проведение конденсации методом смешанных ангидридов в присутствии изобутилхлорформиата позволяет повысить выход на этой стадии до 90%. Реакция отщепления S-Рут-групп и одновременное образование дисульфидного цикла проходит полностью и селективно, исключая межмолекулярное окисление и.образование димеров,; что имеет место при использовании ) известных S-защитных групп. изобретения Способ получения циклического дисульфида метилового эфира N-трет-бутилоксикарбонил-Ь-цистеинил-Ь-цистеина путем последовательного введения SH-защитной группы в гидрохлорид цистеина с последующей обработкой S-защищенного производного цистеина ацилирующим агентом, с последующей конденсацией полученного S-защищенного производного N- Tper-бутилоксикарбонилцистеина с метиловым эфиром S-защищенного производного цистеина, полученного этерификацией S-защищенного производного цистеина метанолом в присутствии хлористого тионила, и последующей обработкой продукта конденсации йодом в метаноле, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода конечного продукта, в -качестве ЗН-защитной .группы используют N-оксиметилпирролидоновую группу, качестве ацилирующего агента используют ди-ТРРТ-бутилпирокарбонат и конденсацию осуществляют методом смешанных ангидридов в присутствии изобутилхлорформиата. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.КешЬег В. Cysteinpeptide aus (S-Ac.etainidomethylcystein)-rpeptiden durch Oxydation mit lod. Die Synteises von eyelo-L-Cystin-HeIv. Chim. Acta. 1971, V. 54, № 3, p. 927-930. 2.Veber D.F., Milkowski J.D., Denkewalter R.G. , |Iirschmann R. The synthesis of peptide in agueous medium IV.A novel protecting group for сysteine. Tetrahedron Sett. 1968, 29, p. 3057-3058. 3.Папсуевич O.C., Арш Г.Ш., Микста С.Я. Бензамидометильные производные L-цистеина и меркаптопропионовой кислЬты.-ЖОХ,1975, т. 45, №6, с. 1384-1388 (прототип).