Метиловый эфир N-трет-бутоксикарбонил-S-пирролидонметил-цистеинил-S-пирролидон-метил-цистеина в качестве исходного продукта для синтеза цистеинсодержащих пептидов Советский патент 1981 года по МПК C07K5/62 

Изобретение относится к новому химическому соединению - цистеинсодержащему дипептиду общей форглулы СИ|Ь- С-вСО-НН- СН- СО-ИН - СН-со- ОСИз йг йг где - (СН, 5-С-ОСО - трет-бутоксикарбонил-(БОС) ; пи рро л и до нме тил (Ру содержащему устойчивую S-защитную группировку, который используется д синтеза цистинсодержащих пептидов, например циклического дисульфида метилового эфира трет-бутоксикарбонил (Вое)-цистеииилцистеииа. Известны цистеинсодержащие ди.1еп тиды с применением Нос-группировки для защиты аминогруппы и S-ацетамид метильной (Аст) или S-бензамидометильной (Btm) группировок для защиты меркаптогруппы цистеина. При использовании производных S-Acm-цистеина (аминокислоты L-KOHфигурации) соответствующий дипептид метиловый эфир, Boc-S-Acm - цистеинил-5-Асп-цистеин получают с общим вьлходом 21%, считая на исходный гидрохлорид цистеина При применении S-Btm-произБОДНых цистеина общий выход соответствующего дипептида составляет 43%, считая на исходный гидрохлорид цистеина 2}. Недостатками известных способов получения S-защищенных аналогов цистеинсодержащих дипептидов являются низкий выход целевого продукта; сложность проведения процесса получения производных S-защищенного цистеина, в частности S-ацетамидометилцистеина; недостаточная устойчивость S-защитных групп (бензамидометильной) к основаниям - растворам едкого натра, гидразингидра,та, применяемым в пептидном синтезе. Предлагается метиловый эфир N-трет-бутоксикарбонил-$-пирролидонмети.пцистеинил- S -пирролидонметилцистеина приведенной выше Фотэмулы.

Это соединение получают алкилированием гидрохлорида цистеина с N-оксиметилпирролидоном с выходом 90%.

Этерификацией гидрохлорида S-Pym-цистеина (I) в метаноле в присутствии хлористого тионила получают гидрохлорид метилового эфира 5-Рут-цистеина (П) с выходом 99,6%.

Ацилированием соединения I с ди-трет-бутилпиррокарбонатом в присутствии гидроокиси натрия получают Boc-S-Pym-цистеин (III) с выходом 98%.

Целевой дипептид - метиловый эфир Вое -S- Рут-цистеинил-S-Р уm-цистеина (IV) получают при конденсации соединения III и соединения II методом смшанных ангидридов с.изобутиловым эфиром хлоругольной кислоты в присутствии N-метилморфолина. Выход соединения IV 90%.

Применение для конденсации карбодиимидного метода позволяет получать дипептид IV с выходом 88%.

Использование производных S-Pym-цистеина в качестве исходного сырья позволяет получить продукт IV с общим выходом 79% (считая на гидрохлорид цистеина)

При отщеплении S-защитных групп от полученного дипептида и одновременным замыканием дисульфидного цикла действием йода в метаноле получают известный в литературе f2j циклический дисульфид метилового эфира Вос-цистеинилцистеина (v) с выходом 92%, Общий выход 73%, т.е. на 51% выше, чем по известному синтезу.

Высокие выходы цистеин- и цистинсодержащих пептидов обусловлены устойчивостью производных S-Pym- цистеина к воздействию различных реагентов, применяемых в синтезе пептидов (кислот, едких щелочей, триэтиламина, аммиака, гидразингидрата), и высокой селективности отщепления S-пирролидонметильных групп йодом в метаноле.

Полученный цистеинсодержащий дипептид - белое кристаллическое вещество, растворим в спиртах, этиловом эфире уксусной кислоты, диметилформамиде, плохо растворим в воде, не растворим в эфире, петролейном эфире, гексане.

Структура нового соединения подтверждена ИК-, ПМР-спектрами, элементным анализом.

Гидрохлорид S-цирролидонметилцистеина (I).

К смеси 15,7 г (0,1 моль) гидрохлорида цистеина, 12,7 г (0,11 моль N-оксиметилпирролидона и 40 мл воды охлажденной до , добавляют при перемещении 15 мл концентрированной соляной кислоты и перемешивают при ксяннатной температуре в течение 30 мин. Образовавшийся раствор выливают в смесь 450 мл изопропилового спирта и эфира (1:2), перемешивают до начала кристаллизации и реакционную смесь оставляют в холодильнике на 4 ч. Продукт отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и перекристаллизовывают из смеси метанола и эфира. Выход гидрохлорида 122,95 г

(90%, считая на гидрохлорид-цистеина) ; т.пл. 174-1750С; CctJ + 4,7°

(с 1, Н20), - 13,4° (с 1, МеОН).

Найдено,%: С 37,70s

Н 5,92; N 10,94.

НС

,,

Вычислено,%: С 37,72; Н 5,94; N 11,00.

ПМР-спектр (DiO + CFjCOOH) ,cf,: 8,46 (2Н, мс, МН); 4,40 (1Н, к, С Н); 3,17 (2Н, м, ); 4,52 (2Н, система АВ, 2, SCHiN) ; 3,61 (2Н, м NCH); 2,48 (2Н, м, NCOCH ),11 м.д. (2Н, м, CCH;z.C) .

ИК-спектр,, HHBD: 3460 (VNH); нужол: 1730 (СО в 5-членном цикле); 1645 (flHH амида I); 1515 (dNH II); 1270 (ffNH амида III).

Гидрохлорид метилового эфира S,1ирролидонметилцистеина (I I).

К 48 мл метанола, охлажденного до -15с,при интенсивном перемешивании прикапывают 2,2 мл хлористого тионила затем добавляют 6 г (0,024 моль) гидрохлорида соединения и полученный раствор перемешивают при 45 С 4ч после чего растворитель отгоняют в вакууме досуха. Остаток перекристаллизовывают из смеси метанола и эфира и сушат в вакуум-эксикаторе над едким кали. Получают 6,27 г соединения II (99,6%, считая на соединение )); т.пл. 70-72c,lfi3 - 5,2 . (с 1, МеОН).

Найдено,%: С 40,17; Н 6,25; N 10,37.

N3,0,5 HCI,

Вычислено,%: С 40,22; Н 6,38; N 10,42.

ПМР-спектр (CF3COOH).(f 8,4 (2Н, мс, N-H); 4,6 (1Н, м с4н); 4,86 (1Н, д, S-CH-N); 4,45 (2Н, К,СООСН2); 3,82 (2Н, т, NCHa); 3,40 (2Н, м, сРна.); 2,88 (2Н, м, COCHj) ; 2,35 (2й, м, C-CHj -C); 1,40 м.д. (ЗН, т, СНз) .

ИК-спектр, см-, HHBD: 3420 (); нужол: 1730 ( в 5-членном цикле); 1640 (dNH амида I); 1520 NH амида II); 1270 ((fNH амида III); 1745 (iJCO сложного эфира),

Н-трет-Бутоксикар6онил-5-пирролидонметилцистеин (III).

10/2 г (0,04 моль) гидрохлорида S-пирролидонметилцистеина (I) растворяют при перемешивании в 80 мл 1 н. раствора едкого натра и приливают раствор 12 г (0/055 моль) ди-трет,-бутилпирокарбоната в 40 мл трет-бутилового спирта. Раствор нагревают при в течение 5 мин, а затем перемешивают при комнатной температуре 2,5 ч. Затем реакционную смесь экстрагируют 50 мл петролейного эф ра, водный слой охлаждают до и подкисляют до рН 3-4 лимонной кис лотой. Подкисленную реакционную мас су насыцают хлористым натрием ( и экстрагируют этилацетатом (3x50 м Этилацетатные вытяжки промывают насыщенным раствором хлористого натрия и затем сушат над безводным сер нокислым натрием. Этилацетатный раствор упаривают в вакууме и к остатку добавляют гексан-Продукт пере кристаллизовывают из смеси этилацет та и гексана. Выход 12,5 г (98%, считая на соединение I); т.пл, 113114 С, 28,3 (с 0,5, ). Найдено, %: С 49,10; Н 6,97; N 8,72. N,,.,N2.05-5. Вычислено,% С 49,04; Н 6,97; N 8,80. ПМР-спектр (ОМ50),сГ: 6,90 1Н д NH); 4,34 (2Н, м, 5СН„К); 4,01 (1Н, м, ); 3,37 {2Н, т, ); 2,75 (2Н, м, NCOCHjp); 2,00 (2Н, м, 1,43 м.д. Сс, ,), . ИК-спектр, см-, HHCD.- 3330 (1 NH); 1725 в 5-членном цикл 1695 (JCO уретана); 1640 cfNH амида 1); 1530 (dNH амида II); 1265 («Тин амида III). Метиловый эфир N-трет-бутоксикарбонил-S-пирролидонметилцистеинил-З-пирролидонметилцистеина (IV). а) Метод смешанных ангидридов. К охлажденному до (-15).-(20)С раствору 1,27 г (4 ®юль) Н-трет-бутоксикарбонил-5-пирролидонметилцистеина в 5 мл диметилформамида прикапывают при перюмешивании 0,44 мл (4 ммоль) N-метилморфолина и затем 0,52 мл (4 ммоль) изобутилового хлоругольной кислоты. Через 10 мин добавляют охлажденную смесь 1,075 г (4 ммоль) гидрохлорида метилового эфира S-пирролидонметил-1-цистеина и 0,44 мл (4 ммоль N-метилморфолина в 5 мл диметилформ амида И-перег/юшивают еще 3,5 ч при (-15)-(-20)С. После завершения . реакции смесь разбавляют водой и эк рагируютэтиловым эфиром уксусной кислоты. Органический слой промьшаю последовательно 0,25 и. 1 аствором бикарбоната натрия, 0,05 н. рхаствором серной кислоты и насыщеиньед рас вором хлористого натрия и сушат над безводным сульфатом натрия. Растворитель упаривают в вакууме и к оста ку добавляют гексан.Полученный продукт перекристаллизовычают из смеси этилового эфира уксусной -кислоты и гексана. BttxoR 1,92 г (90%) ;т.пл. 7 8(f C, 47,8 (с 0,1,(МеОН). Найдено,%: С 49,54; Н 6,94; N 10,41. C2iH3eN40-,S Вычислено,%: С 49,61; Н 6,91; 10,52. ПМР-спектр (СОС1з),0- 5,4 (1Н, NH;; 5,26 (1Н, л, NH), 4,:i,2 (1Н, ) ; 4,34 (4Н, м, S-CH- -N и ); 3,70 (1Н, м, ), ,52 (ЗН, с, СООСН) ; 3,02 (4Н, т, NCH, NCH/i); 2,90 (4Н м, ,) ; 2,4 (4Н, м, СН2-СО и CH,j-CO); 2,0 (4Н, м, C-CIii-C и С-СН--С) ;1,42 М.д. С9Н, с, С(СН) ИК-спектр, см , HHBD: 3420 (VNH) ; нужол: 1730 (VCO t; 5-членном цикле); 1745 (VCO сложного эфира); 1695 (VCD уретана); 1640 S/WH амида I); 1530 ((fNH амида 11); 1270 ((НН амида III). б) Карбодиимидный метод. К охлажденной до О смеси 1,075 г (4 ммоль) гидрохлорида метилового эфира S-пирролидонметилцистеина и 1,27 г (4 ммоль) N-трет-бутоксикарбонил-S-пирролидонметилцистеинав 5 мл ацетонитрила добавляют 0,56 мл (4 ммоль) триэтиламина и 0,82 г (4 ) дициклогексилкарбодиимида, перемешивают 30 мин при 0-(-5)с и оставляют на ночь в холодильнике, после чего дициклогексилмочевину отфильтровывают, и фильтрат упаривают. Остаток растворяют в хлороформе, полученнный раствор промывают последовательно 0,25 н. раствором бикарбоната натрия, 0,05 н. раствором серной кислоты и насыщенным раствором хлористого натрия и высушивают над безводным сульфатом натрия. Остаток после отгонки растворителя перекристаллизовывают из смеси этилового эфира уксусной кислоты и петролейного эфира. Выход 1,88 г (88%, считая на соединение .И);т.пл. 78-79, 47,1 (с 0,1, ИеОН). На1.дено,%: С 49,51; Н 6,84; N 10,42. ПМР-спектр -( ). 5,4 (1Н, д, МН) 5,26 (1Н, д, NH); 4,52 (1Н, м, cfH); 4,34 (4Н, м, 5-CH,-N и );3,70 (1Н, м, ) ; 3,53 (ЗН, с, СООСНа); 3,02 (4Н, т,МСНй. и NCH); 2,90 (4Н, м, и C%Ii) ; 2,4 (4Н, м , СНу-СО и CHjj-eO); 2,0 (4Н, м, C-CHj-C и );1,42 м.д. t9H, с, C(CHj) ИК-спектр, , HilBD: 3420 (INH); нужол: 1730 ( СО в 5-членном цикле); 1745 ( сложного эфира; 1695 (-усб уретана); 1640 (аЫН амида I); 1530 (ONH амида I t) ; 1270 (0NH амида 111). Циклический дисульфид метилового эфира Ы-тр ет-бутоксикарбонилцистеинилцистеина (V). К раствору 1,27 г (5 ммоль) йода в 5 мл метанола прикапывают в течение 30 мин раствор 0,67 г (1,25 ммоль) метилового эфира Bos-S-пирролидонметилцистеинил-5-пирролилонметилцистеина в 30 мл метанола, после чего смесь перемешивают еще

40 мин. После охлаждения до О добавляют 1 и. раствор тиосернокислого натрия до слабо-желтой окраски, смес упаривгиот до 10 мл; разбавляют хлороформом, промывают 0,5 н. раствором тносернокислого натрия и водой, высушивсиот над безводным сульфатом натрия. Растворитель упаривают, остаток выкристаллизовывают при добавлении петролейного эфира. Выход посл перекристаллизации из смеси хлороформа и петролейного эфира 0,39 г (92%, считая на соединение IV); т.пл. lae-lBT C 67,(с 1, МеОН). Общий выход 73% (на гидрохлорид цистеина).

Найдено,%: С 42,97 Н 6,04; N 8,30.

2.

Вычислено,%: С 42,89; Н 5,99;

N 8,33.

Литературные данные: т.пл. 185487 С - 65° (с 1,87, МеОН);

найдено,%; С 42,78 Н 6,05; N 8,17;

т.пл. 185-187с; , - 64, (с .1,87, МеОН); найдено,%: С 43,13;

Н 6,21 N 8,38.

ИК-спек,трЬ сняты на спектрофотометре Pei-k i п-Е lmer-325 в области 650-3500 см- (ННеО, нужол).

ПМР-спектры записаны на спектрофотометре модели R-12A (СО МГц) фирмы Perkin Elmer.

Формула изобретения Метиловый эфир N-трет-бутоксикарбонил- S -пирролидонметилци :теинил-S-пирролидонметилцистеина общей формулы ICHjb-С-OCO-NH-СН-СО-ИН - СН-СО-OCHj

снг сн,

S S

снг

СН2

fr U

в качестве исходного продукта для синтеза цистеинсодержащих пептидов.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.В. Kamber Не(v. Chim. Aeta, 1971, 54, 927-930.

2.Папсуевич О.С. и др. ЖОХ, 1975, 45(6), 1384-1388.