Способ определения степени цитопатогенности нейссерий Советский патент 1982 года по МПК C12N1/00 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ЦИТОПАТОГЕННОСТИ НЕЙССЕРИЙ

1

Изобретение относится к медицине, а именно микробиологии.

Известен способ определения степени цитопатогенности нейссерий путем инфицирования клеточной культуры суспензией микроорганизмов с последующим подсчетом количества дегенерированных клеток {1.

Однако известный способ является длительным и недостаточно чувствительным.

Цель изобретения - ускорение и повышение чувствительности способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения степени цитопатогенности нейссерий путем инфицирования клеточной культуры суспензией микроорганизмов с последующим подсчетом количества дегенерированных клеток в качестве клеточной культуры используют. однослойную культуру перевиваемого амниотическото эпителия человека, предварительно синхронизированную выдерживанием при 10±0,1°С в течение 3 ч, при зтом инфицирование проводят последовательно суспензией микроорганизмов, содержащей 2 10 ±1.4-10 и 8-10 ± 2,810 мик

робных тел/мл, и подсчет количества дегенерированных клеток проводят через 6 и 24 ч инкубации.

Пример 1. Готовят однослойную 18-часовую культуру клеток в пробирках при посевной дозе 400000-50000 клеток на мл. среды, используя маточную перевиваемую культуру амниотического эпителия человека общепринятым методом. Для выращивания клеток используют среду 199 с

10 Д0% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиками (пенициллин 100 ЕД/мл, стрептомицин 50 ЕД/мл). Штатив с пробирочными 18-часовыми культурами клеток помещают в рефрижератор с температурой 10° С на

15 3 ч для синхронизации клеточной культуры.

Испытуемую- культуру нейссерий 16-20часового роста на сывороточном агаре Хоттиштера смьшают физиологическим раствором . (рН 7,0-7,2) и готовят микробные взвеси

20 20 ЕД и 5 ЕД по национальному стандарту ГИСК, что соответствует 2-10 и 5-10 микробных тел в 1 мл, Перед заражением в культуре клеток проводят смену росто39вой среды на поддерживающую среду 199 без сыворотки и антибиотиков. Затем приготовленные микробные взвеси испытуемого штамма нейссерий в объеме 0,4 мл вносят в 3- 4 про&1рки с клеточной культурой, т.е. по 8- 10 я 2-10 микробных тел на пробирку с культурой клеток. Доза 8 10 микробных тел вызывает четко выраженный цитопатическнй зффект через 6 и 24 ч после заражения клеток в зависимости от степени вирулентности испытуемых штаммов -менингококка и не дает ответной реакции клеток в случае непатогенных нейссерий. Доза с содержанием 2 10 микробных тел является пороговой для менингококков при наблюдении через 24 ч после заражения и ареактивной для непатогенных нейссерий. Для контроля клеточной культуры оставляют 4 пробирки с поддерживающей средой незараженными. Опытные и контрольные про бирки инкубируют при 37° С в течение 24 ч. Через 6 ч проводят первое чтение щпопатического эффекту, наблюдая опытные клеточные культуры в сравнении с контрольными под микроскопом при малом увеличении (об. 8х, ок. 10х). Цитопатический зффект оценивают по четырехкрестовой системе соответственно проценту погибших клеток: 100% (н-н-), 75% (+++), 50%(++), 25%(+) клеток монослоя. Отсутствие цитопатического эффекта обозначают знаком (-). Через, 24 ч проводят второе чтение результатов. Определение степени цитопатогенности испы туемого штамма нейссерий проводят по ответной щпопатической реакции, на обе диффе ренцирующие дозы нейссерий с учете срока ее развития (б ч или 24 ч)..Высоков1фулент ными менингококками считаются те, , которые через 6 ч вызывают дегенеративные изменения у 75-100% клеток (для свежевьщеленных штаммов) или через 24 ч (для . хранившихся штаммов). Вирулентными считаются штаммы менингококков, обусловливаю щие гибель 25-30% клеток на 24 ч, авирулентными - штаммь, не вызывающие цитопатического зффекта. В контрольных npo&i(v ках дегенеративные изменения отсутствуют. Способ определения степени nHTonaToreHHOo ти нейссерий апро&1рован при изучении 16 эталонных и 124 свежевыделенных штаммов нейссерий. Использование изобретения позволяет шить диагностику менингококковой инфекции. Формула изобретения Способ определения степени цитопатогенности нейссерий путем инфицирования клеточной культуры суспензией микроорганизмов с последуюшнм подсчетом количества дегенерированных клеток, о.-т лишающийся, тем, что, с целью ускорения и повышения чувствительности способа, в качестве клеточной культуры используют однослойную культуру перевиваемого амниотического зпителия человека, предварительно синхронизироваш) выдерживанием при 10±0,1° С в течение 3 ч, при этом инфицирование проводят последовательно суспензией микроорганизмов, содержашей ,4«10 и 8«1б«±2, микробных тел/мл, и подсчет количества дегенерированных клеток проводят через б и 24 ч инкубация. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Дударева В. В. Менингококковая инфекция. Труды ЛСГМИ, Л., 1978, с. 63-65.