Штамм перевиваемых клеток почки новорожденного кролика для производства и контроля медицинских вирусных препаратов Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано в вирусологии.

Целью изобретения является получение нового штамма, перепиваемого клеток почки новорожденного кролика, чувствительного к вирусам простого герпеса и парагриппа 1-3 типов и аденовирусу типа 7. итамм депошро- ван ВСКК (СЖ) под номером 27. Авторы назвали штамм П11К-86.

Корфолог ические признаки .

I JTaMM перевиваемых клеток пред- стапляет плотный монослш полигональных ютеток с оть,. Н1,1.а: ;ен1 о; структурой. Цитоплазма клеток (ветлая с мелкой зернистостью. Ядра округлой формы, содержащие по 2-6 ядрышек. №1тотическая активность клеток на 25 пассаже составляет 30-34% на 2 сутки роста. Модальный класс слабо выражен 23% клеток, содержит 66 хромо- с ом. Число хромосом в кариотипе варьирует от 41 до 85 .

Физиологические признаки.

/Слетки сним;1ют со стекла 0,02%- пым раствором Версена. При нппетиро- вании образуется одноцоднам лзнесь клеток. Жизнесп(собпость 1.ч-11евивае- мых клеток ПНК-Л6 ггодпсржтм спот путем

СО 4

00

регулярных пересепон на свежую пита- I лпьную среду, состоящую из среды 199-457, среды Игла-45%, 10% нативной сыворотки мододняка крупного рогато- го скота и антибиотиков (пенициллин 100 ед/мл и стрептомицина 50 ед/мп) рИ среды 7, 2-7,4 .

Частота пересевов через 4 дня, коэффициент пересева 1:3-1-4.

Пример. 1тамм перевиваем1)ГХ 1 ;еток получают из почки новорождениого кролика. Первичную культуру получают методом дезагрегации кусочков opiann 0,25%-ным раствором трипсина н течение 10 ч инкубации в холодильнике при 4°С. Раствор трипсина cjui- .чают, а кусочки ткани заливают сре- до11 Игла и 199 в равных соотношениях дли суспендирования: в первую порщ1ю через 3 ьшн сливают, порции взвеси iTocjie 2-5 ресуспендирования сливают л одну колбу, доводят до концентрации 400-500 тыс.кд/мп добавляют 10% натмвный бычьей сыворотки и культи- ируют до появления монослоя клеток при 37°С со сменой среды на 2 сутки роста. Первичная культура формирует моносдой )ia 4-5 сутки роста полимор- гЬными клетками с преобладанием фиб- робластоподобных с зернистой цитоплазмой. На 4-5 пассаже клетки приобретают более четкие границы и выраженную цитоархитектонику, а куль- Тура приобретает стабильный характер роста. Пассирование осуществляют через 3-4 суток в соотношении 1-2,

Начиная с 25-27 пассажа на фоне фибробластоподобных появляются клетки эпителиеподобного типа с крупны- ми ядрами овальной или округлой формы, содержащие от 2 до 6 ядрышек. К 29-30 пассажу эпителиеподобные клетки становятся .преобладающими. Кратность прироста клеток на 3-4 сутки роста 30 пассажа соответствует 4,5- 5,0.

На 8 пассаже до 82% популяции составляют клетки с дипплоидным на- бором хромосом. В процессе культивирования происходит увеличение числа хромосом в клетках. На 25 пассаже число хромосом в клетках варьировало от 41 до 85, Модальный класс пре ставлен клетками с 66 хромосомами и соответствует 23%. Более 50% иссле- дованн1-1Х метаЛаз содержит от 66 до 78 хромосом.

/VIH проткчжи K.rieTfiK ПНК-86 на наличие нирусных контамии.- итов исполь- зук1Т мето;; с менинных культур-па сси- р знание nojiy4L HHbix кчеток на первично триси1сичиронаннь х клетках почек эмбриона человека, а также реак1дии геиадг,()1)бций с истшьзопанием эритроцитов кур, морской спинки и человека. Использование птим методом не выявляет в клетках цитопатогенных агентов.

Контроль присутствия микоплазм проводят с использованием 0,3% полужидкого агара на триптическом переваре сердца крупного рогатого скота, методом авторадиографии по Р-тими- дину.

Клетки ПНК-86 заложены в фонд низкотемпературного банка-музея клеточных культур СНИИВН на различных пассажных уровнях 6, 10, 15, 20, 26. Колдекц1Н)нный номер культуры по коллекции СНИИВИ 230/86.

Режим замораживания: для замораживания отбирают и просматривают под микроскопом моносло11ные культуры клеток с четкой структурой. Клетки снимают со стекла, воздействуя 0,02% раствором Версена. Взвесь разливают по ампулам в концентрации 2,0-2,5мп в мл. Среда криоконсерваНии для клеток ПНК-86 состоит из среды Игла 407 среды 199 40%, сыворотки молодняка крупного рогатого скота 10, глицерина х/ч 10% и антибиотиков (пенициллин 100 ед/мл и стрептомицин 100 мкг/мп). Запаянные ампулы вьщер- живают в рефрижераторе при 4-6°С в течение 1-2 ч, затем замораживают в аппарате АХК-4 со скоростью 0,5 град/мин от О до -20°С,4 град/ми от -20 до , 10 град/мин от -40 до с последующим.погружением в сосуды Дьюара (типа АСД-50) с жидким азотом при -19б С.

Режим восстановления: ампулы с замороженной клеточной взвесью извлекают из сосуда Дьюара и помещают в водяную баню при 40°С для оттаивания. Размороженную суспензию клеток переносят из ампул в матрасы с небольшим количеством ростовой среды, перемешивают, производят подсчет живых клеток, доводят средой роста концентрацию клеток до посевной (100-150 тыс/мп) и помещают в термостат при 37°С. После 24 ч роста проводят смену среды роста для удале5

Ш1Я криозашлтиого вещестпа (глицерина) . Монослой формируется на 4т 5 сутки роста.

Испопьзопание штамма: анализ чувствительности клеток П11К-86 показал, что вирус 1фостЬго герпеса 1 типа штамм Л2 размножается в клетках, вызывая дегенерацию при пер личном заражении через 48 ч и при пассирова- Ш1И через 24 ч после заражения. Показатели инфекдаонной активности указанного вируса составляют 3,0-4,0 ед Ig .

При иммунофлуоресцентном исследовании клеток ПНК-86 на 24-30 пассажных уровнях через 24 ч после заражения вь чнляют наличие вирусоспег ифи- ческого аитегена в ядрах 30-55% клеток. Являясь высокочувствительной культ тэой к вирусу простого герпеса, ПИК-86 широко используют для получения опытных серий люминесцирую11ц 1х иммуноглобулинов к вирусу простого герпеса,

Птамм перевиваемых клеток П11К-86 отличается чувствительностью к аденовирусу типа 7. Максимальные титры накопления аденовируса в культуре 28- 30 пассажей составляет 4,5-5,0 ед ТПЛ5о/ через 96 ч после заражения.

7

Эти данные с вид ет ел ьс т в тот о том, что штамм клеток IHK-86 может быть использован для получения соответствующих диагностических препаратов.

При сравнительном анализе чувствительности клеток ПНК-86 к вирусу парагриппа 1, 2 и 3 типов устанавливают, что при инфицировании клеток вирусом ПГ 3 типа отмечают накопление гемагглютининов в титре 1 : на 10 сутки ч в более поздние сроки, в то же время наступает и дегенерация клеток. Вирус ПГ 1 типа размножается в клетках с проявлением дегенерации на 12-13 сутки, с накоплением гемагглютининов на 9 сутки в низких титрах. Клетки ПНК-86 чувствительны и к вирусу ПГ 2 типа без накопления гемагглютининов, но с проявлением признаков дегенерации на 12-14 сутки. Чувствительность клеток ПНК-86 позволяет рекомендовать их для возможного использования в производстве

диагностических препаратов.

Формула изобретения

Штамм перевиваемых клеток почки новорожденного кролика ВСКК (СХЖ) 27 для производства и контроля медиш1н- ских вирусных препаратов.

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано в медицинской вирусологии. Перевиваемый штамм клеток ПНК-86 обладает стабильными морфо-физиологическими характеристиками и чувствительностью к вирусу простого герпеса, аденовирусу типа 7 и к вирусу парагриппа 1-3 типов. Клеточный штамм, охарактеризованный в количестве 100 ампул с содержанием 2-3 млн клеток в каждой ампуле, хранится в низкотемпературном (-196)°С. Республиканском банке-музее клеточных культур на базе СНИИВИ, являющемся базовым учреждением Всесоюзной коллекции клеточных культур.