Изобретение относится к вирусологии, в частности к производству иммунобиологических препаратов.
Вируссодержащая жидкость с высоким содержанием вируса является исходным материалом при производстве вакцин и получении диагностических препаратов, а также для изучения биологических свойств штаммов вируса с разной степенью аттенуации, в т.ч. вакцинных. Дальнейшая последовательная обработка вирусной жидкости зависит от требуемого конечного продукта и технологических условий. Вируссодержащая жидкость используется как составная часть диагностического или вакционного препарата; антиген для иммунизации животных при получении гипериммунных диагностических сывороток; исходный материал для получения гемагглютинирующего коревого антигена.
Согласно данным литературы для производства различных иммунобиологических препаратов и изучения биологических свойств вируса кори используют разные штаммы вируса кори штамм Эдмонстон (Enders a Peebles, 1954), штаммы Л-1, Л-2, Л-3, Л-4, Л-5 (Смородинцев А.А. Бойчук Л.М. Шикина Е.С. 1958) штаммы Л-14, Л-16 (Тарос Л.Ю. 1960), штамм вируса кори (Izbicky Alexej, авт. св. ЧССР N 185430, кл. C 12 K 7/00, 1980).
Вместе c тем инфекционная активность вируса кори на разных клеточных культурах не превышала 106,0 ТЦД50) (Parfanofich et al, 1966, Dosser et al. 1962, Drevo et al. 1970, Kohn et al. 1962, Toyoshima et al. 1959, Bikens J. 1960, Vnolerwood, 1959, Zhelonov et al. 1959), а гемагглютинирующая активность относительно низка 1:2-1:4 (в единичных случаях 1:16) (Strauss et al. Hyg, Epid, Microb, Immunol, 9, 287, 1965; Дорофеева Н.К. Акта вирологика, 19, 497, 1975; Katz et al в книге "Лабораторные методы исследования вирусных и риккетциональных инфекций"; Zenetle et al, Praha 1974).
Так штамм Эдмонстон, выделенный в 1954 году американским исследователем Эндерсом из крови больного Эдмонстон в первичной культуре почек человека, прошел 40 пассажей в первичной культуре амниона человека, 24 пассажа в первичной культуре клеток почек человека, 14 пассажей в культуре клеток РН и 6 пассажей в перевиваемой линии клеток лейкемии человека L-41. В результате пассирования штамма Эдмонстон на различных перевиваемых культурах клеток были получены образцы вируссодержащей жидкости с гемагглютинирующей активностью 1: 2 1:16, титр инфекционности не более 106,0 ТЦД50. В лаборатории штамм Эдмонстон прошел 12-17 пассажей на перевиваемых культурах клеток ПАО, L-41, Hep-2, Vero, при этом гемагглютинирующий титр вируссодержащей жидкости ни в одном из экспериментов не превышал 1:16, а титр инфекционности 105,0 ТЦД50. Следует отметить, что гемагглютинирующая активность штамма Эдмонстон часто не коррелировала со значением инфекционного титра. Титр гемагглютинирующего антигена, приготовленного по методу Norrby (1962), составлял 1:32-1: 512 (титр 1:512 был достигнут только в 6 из 53 опытов). Нестандартность полученных результатов и низкий титр гемагглютинирующей активности антигена затрудняют производство коревых иммунобиологических препаратов на основе этого штамма.
Цель изобретения: штамм вируса кори, обладающий высокой гемагглютинирующей и инфекционной активностью.
Штамм вируса кори Бук депонирован в Государственной коллекции вирусов института вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН России г. Москва под N 2211.
Получение штамма. Материалом для выделения штамма вируса кори служит гепаринизированная кровь больного корью: на 5 мл крови добавляют 500 ЕД гепарина, разведенного в 1 мл физиологического раствора. Фракцию лимфоцитов получают из гепаринизированной крови в градиенте плотности фиколл-верографина. При этом гепаринизированную кровь разводят фосфатным буфером и осторожно наслаивают на смесь, состоящую из 16 частей 9%-ного фиколла и 7 частей 36,2% -ного верографина (плотность смеси 1,077 г/мл). Образовавшийся ступенчатый градиент плотности центрифугируют при 400 g в течение 35 мин. Лимфоциты, скопившиеся в интерфазе, отсасывают и отмывают сначала фосфатным буфером, а затем средой RPM1.
Выделение вируса проводят на перевиваемой культуре клеток Vero в бессывороточной среде RPM1: в ряд пробирок с монослоем клеточной культуры наносят суспензию лимфоцитов и адсорбируют их 6 ч при 37оС. Затем содержимое пробирок отсасывают, вносят поддерживающую среду RPM1 и инкубируют при 36оС. Просмотр пробирок осуществляют ежедневно, смену среды в опытных и контрольных пробирках проводят через 5-6 дней.
В опытных пробирках регистрируют появление цитопатических изменений на 14 день культивирования. При их отсутствии проводят 2-3 "слепых" пассажа. Цитопатогенные изменения в культуре ткани в опытных пробирках типичны для вируса кори многоядерные синцитии (симпласты) с нуклеиновыми и протоплазматическими включениями.
Характеристика штамма. Новый штамм Бук соответствует единой структуре вируса кори (сравнение полипептидного спектра в ПААГ со шт. Эдмонстон). Его инфекционная активность легко уничтожается физическими и химическими средствами (рН, тепло, ацетон, формалин). Выделенный штамм Бук агглютинирует эритроциты обезьян и не агглютинирует эритроциты кур, морских свинок, голубей, баранов.
Типичным признаком нового штамма является активное размножение его в культуре клеток гетероплоидной линии Vero, получение вируссодержащей жидкости с титром инфекционности 106,5-7,0 ТЦД50 и гемагглютинирующей активности 1: 128-1: 256. Определение титра инфекционности проводят методом титрования в культуре клеток Vero с десятикратным разведением вирусной суспензии на физиологическом растворе. Окончательный учет проводят на 12-14 день методом гемадсорбции с 0,05%-ной взвесью эритроцитов обезьян, что в свою очередь является характерным тестом, подтверждающим размножение вируса кори в культуре клеток. Характерным признаком нового штамма вируса кори Бук является нейтрализация его специфическими противокоревыми антителами. Реакцию нейтрализации проводят на перевиваемой линии культуры клеток Vero. В качестве антительных препаратов используют специфический противокоревой лошадиный гамма-глобулин (национальный стандарт, ГИСК им. Тарасевича), гипериммунную сыворотку к вирусу паротита и гипериммунную сыворотку к вирусу краснухи (табл. 1).
Антигенная характеристика штамма Бук. Кроликов иммунизируют двухкратно с интервалом 7 дней. Первоначально вводят вируссодержащую жидкость с адъювантом Фрейнда внутримышечно в объеме 2,0 мл, затем внутривенно в объеме 1,0 мл без адъюванта. Сыворотку получают на 7 день после 1 иммунизации и на 7, 10, 14, 21, 30 день после второй иммунизации. Содержание противокоревых антител определяют в РТГА по общепринятой методике с 4 ГАЕ коревого антигена (шт. Эдмонстон). Полученные результаты позволяют выявить динамику синтеза противокоревых антигемагглютининов на введение штамма Бук вируса кори (табл. 2).
Специфичность коревых антител подтверждают в реакции "гашения" с коревым антигеном (шт. Эдмонстон).
Культивирование штамма и получение вируссодержащей жидкости. Биологическим субстратом для размножения шт. Бук вируса кори является культура клеток гетероплоидной линии Vero, производная из почек обезьян. Для культивирования клеток используют среду RPM1 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки. Инкубацию клеточных культур осуществляют при 37оС. Клеточные культуры (монослой) инфицируют инокуляцией вируса в общий объем среды не менее 0,01 ЦПД50 на клетку. Инкубацию инфицированных культур проводят при 36оС в бессывороточной среде RPM1.
Вируссодержащую среду можно получить однократно или многократно: при одноразовом получении инфицированные культуры инкубируют до отделения 70-80% клеток от стенок культивационной посуды. Перед сливанием клеточные культуры со средой подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию. Затем вируссодержащую жидкость осветляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин, ампулируют и хранят при -70оС. Для длительного сохранения инфекционного вируса проводят лиофилизацию с последующим хранением в холодильнике при 4оС; многократное получение вирусной жидкости проводят заменой среды с инфицированных клеток при появлении 30-40% цитопатического эффекта каждые 24 ч. Последнюю смену осуществляют при 50%-ном поражении инфицированных культур.
Такими способами можно получить вируссодержащую жидкость с титром инфекционности не менее 106,5-7,0 ТЦД50 и гемагглютинирующей активностью с титром не ниже 1:128-1:256. Гемагглютинирующий антиген получают по методу Norrby (1962) вируссодержащую жидкость обрабатывают твином и эфиром с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин. При такой обработке гемагглютинирующая активность увеличивается по сравнению с исходной в 4-16 раз.
Использование: вирусология, производство иммунобиологических препаратов. Сущность изобретения: получен штамм вируса кори, обладающий высокой инфекционной и гемагглютинирующей активностью. Штамм вируса кори выделен из фракции лимфоцитов крови больного корью в активной фазе заболевания. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов под номером 2211. Штамм может быть использован при производстве диагностических и вакцинных препаратов. 2 табл.
Штамм вируса кори ГКВ N 2211 для приготовления иммунобиологических препаратов.
| Лабораторные методы исследования вирусных и риккетсиозных инфекций | |||
| Прага, 1974. |
