1
Изобретение относится- к медицине, в частности к способам исследования кожи.
Известен способ определения фракционного состава расторимых белков кожи путем ее гомогенизации., экстрагирования фосфатным буфером в течение 1 сут и центрифугирования с последующим разделением белковых фракций в .супернатанте методом дискэлектрофореза в полиакриламидном геле. Способ дает возможность выявить 6-8 белковых фракций в нормальной и до 18 фракций в патологической коже tOОдиако известный способ не позволяет получить более полного представления о спектре растворимых белков кожи, что важно при диагностике различных патологий кожи.
Цель изобретения - выявление большего числа фракций, т.е. наиболее полного состава (25-29 фракций) растворимых белков кожи.человека и сокращение продолжительности процесса..
Указанная цель достигается способом определения фракционного состава растворимых белков кожи, включающим гомогенизацию пробы, экс тракцию белков и центрифугирование с последующим разделением белковых фракций в супернатанте методом диск10электрофореза в полиакриламидном геле, согласно которому гомогенизацию пробы ткани проводят одновременно с экстракцией в. присутствии кварцевого песка и физиологическо«5го раствора в соотношении 2:1: в течение 20-25 мин, а центрифугирование осущест яют в течение мин .при 8000 об/мин.
20
Кроме того, диск-электрофорезу подвергают пробу супернатанта, содержание белка в которой составляет 600-1000 нг. Процесс обработки пробы и выявление фракционного состава белков в дут на холоду (0-4 с) Разделение белков кожи на фракци проводится известным методом в ПААГ 2}, но в подготовку пробы белков кожи (экстракта белков кожи) внесено ряд существенных изменений, влияющих на конечные результаты этого известного метода. Для получения экстракта (или супернатанта) в достаточном количестве для исследования с нужным содержанием белков (не менее -51) необходимо растирать ткань с кварцевым песком и физиологическим раст вором в определенном соотношении 2:1:А в течение 20-25 мин при При растирании ткани менее 20 мин гомогенизат неоднороден и с -низким содержанием белков. При более длительном растирании на старте гелефореграммы появляется денатурируемый белок. Важную роль для получения положительного эффекта оказывает прием центрифугирования гомогенизата. Наилучшим вариантом является центрифугирование при 8000 об/мин в те чение мин. При меньших оборотах центрифуги не успевает формироваться плотный осадок в результате чего супернатант мутный, что мешает его дальнейшему исследова5нию.При более продолжительном времени центрифугирования появляется денатури|зованный белок на старте. Одним из основкых условий наилучшего выявления различных белковых фракций является достаточное содержание белков в исследуемой пробе. Оптимальным содержанием белков в пробе является 600-1000 нг. При более низкой концентрации снижается количество выявляемых фракций, а при более высоком содержании затрудняется разделение белковых фракций. Пример. К 0,5 г охлажденной кожи человека, взятой послойно (эпидермис, дерма и цельная кожа) на всю толщину-э.лектродерматомом у лиц, подвергшихся оперированию (эппендэктомия, грыжесечение), предварительно отмытой физиологическим раствором от крови, измельченной и помещенной в фарфоровую ступку, добавляют 0,25 г кварцевого песка и 2 мл охлажденного физиологического раствора и гомогенизируют на холоду (0- С) в течение 20 мин, после чего гомогенизат количественно переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 40 кмн. В полученном супериатанте определяют.содержание бел ка по методу Лоури. Содержание белка в различных проах-образцах приведено в taбл. 1. Т а б л и ц а 1
В неразведеином супернатанте, г. t,29
В 01, мл неразведенного супернатанта, нг
В01 , мл супернатанта, разведенного физраство1800ром, нг
В 0,1 мл супернатанта разведенного физраствором и крупнопористым гелем, нг
4,68
4,82
4,36
4820
4360 4680
2400
2400
1800
800
800
600
Исходя из количественного содержания белков в супарнатанте разводят его физиологическим раствором (табл. 1) с таким расчетом, что в о,1 мл раствора содержится 1800-2 00 н белка .Затем смешивают разведенный супернатант с раствором крупнопористого геля в соотношении 1:3 ( к 0,1 м разведенного супернатанта iO,. мл крупнопористого геля), пйсле чего в О,1 иг смеси содержится бОО 1000 нг белков (табл. 1). Это количество наносят на трубочки с полиакриламидным гелем для разделения на фракции. Разделение (фракцирование) белков проводят на приборе для диск-электрофоре за ( Реанал, согласно известной методике 2J в холодильной камере (). Сила тока в первые 30 мим не должна превышать 2 МА на трубочку, затем ее увеличивают до Л МА на трубочку.
После электрофореза гелевые столбики извлекают из трубочек и помеМедленные пострансферрины
0,15
0,21 0,26 0,32 0,Н 0,53
щают на 20 мин в пробирки с раствором красителя и фиксатора (ам дочерный 10 В в растворе уксусной ки слоты).
После окрашивания гелевые стол бики многократно отмывают раствор ом -уксусной о слоты до полного вымывания красителя, не связанного с белками.
На отмытых гелефореграммах всех четырех проб-образцов кожи было вы явлено 25-30 фракций (табл. 2).
Предлагаемый способ дает возмсвкность получить в пробе супернатанта белка 600-1ООО нг, а при разделении этих проб методом диск-электрофореза в полиакриламидном гел выявить 25-30 белковых фракций с определенной электрофоретической подвижностью.
Рас-прёделение белковых зон и отдельных фракций на гелефореграммах различных проб - образцов нормальной кожи человека показано в табл. 2. Таблица 2
0,12
0,12 0,15 0,15
t 0,18
0,18 0,21 0,21
0,32 0,
0,41+ 0,53 0,5 0,67 0,67
На чертеже приводится схема расположения на гелефореграммах выявленных белковых фракций нормальной кожи.
Использование изобретения перспективно для оценки состояния за1читных механизмов в преморбидном состоянии и при различной патологии кожи.
Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в том,
что предлагаемый способ позволяет упростить процесс .и одновременно выявить большее количество белковых фракций (до 29),что позволит по изменению состава фракций растворимых
белков-кожи в патологии установить индивидуальные особенности различных кожных заболеваний. Продолжительность процесса сокращается до 1 ч.
