СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ И РАЗДЕЛЕНИЯ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ И МИОФИБРИЛЛЯРНЫХ БЕЛКОВ МЯСА НА ФРАКЦИИ МЕТОДОМ ОДНОМЕРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ Российский патент 2014 года по МПК A23J1/02 

Описание патента на изобретение RU2524546C1

Изобретение относится к биологии, в частности к биохимии и молекулярной биологии, и может найти применение при разделении саркоплазматических и миофибриллярных белков мяса на фракции в полиакриламидном геле.

Метод зонального электрофореза в полиакриламидном геле широко используется при исследовании биологических макромолекул. Его высокая разрешающая способность позволяет не только разделять смеси, содержащие большое число разных видов макромолекул, но и характеризовать их по заряду, молекулярной массе и конфирмации (Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул: Пер. с англ. / Э.Гааль, Г.Медьеши, Л.Верецкеи - М.: Мир, 1982. С.74) [1].

Наиболее близким к заявляемому является способ экстракции и разделения саркоплазматических и миофибриллярных белков свинины на фракции методом одномерного электрофореза в полиакриламидном геле предложенный Aro A. Juan М. (Aro A. Juan М. Влияние времени обработки органическими кислотами на протеолитические изменения в сухих и полусухих колбасах / Aro A. Juan М., Chaina S. Amelia, Segura P. Roger, Sekikava Mitsuo // Материалы 56-го Международного конгресса по вопросам науки и технологии мясной промышленности. Пер. ВНИИМП. (15-20 августа, 2010 г., Джеджу, Корея). - М.: Изд-во ВНИИИМ - 2010. С.610.) [2].

Согласно данному способу четыре грамма исследуемого образца свинины гомогенизировали в 40 мл 0,03 М калий-фосфатного буфера (pH 7,4) в течение 2 мин при 13500 об/мин. Гомогенат центрифугировали при 10000 об/мин и температуре 4°C. Полученный супернатант содержал саркоплазматические белки. Из оставшегося осадка путем гомогенизации в течение 2 мин в растворе, содержащем 2 М молярную мочевину и 1% 2-меркаптоэтанол, экстрагировали миофибриллярные белки. Гомогент центрифугировали в тех же условиях, полученный супернатант содержал миофибриллярные белки.

Образцы саркоплазматических белков разводили 1:1 с помощь буфера для электрофореза и нагревали при 100°C в течение 5 мин. Электрофорез проводили в 12,5% разделяющем и 6% концентрирующем геле, при напряжении 120-150 В, в течение 4-6 часов. В каждую электрофоретическую ячейку было закапано по 10 мкл исследуемых образцов. Окраску проводили с помощью кумасси бриллиантового голубого R-250, 30% метанола и 10% уксусной кислоты. Молекулярные массы белков определяли с помощью пропускания через гель белков с известной массой. Гель после электрофореза отмывали и фотографировали.

Полученные согласно данному способу электрофореграммы не дают четкой картины разделения белковых треков из за неэффективной экстракции белков и чрезмерной плотности геля. Также необходимо отметить длительность процесса фракционирования - 4-6 часов, селективность способа - возможность электрофракционирования только белков свинины.

Недостатками данного способа являются:

- недостаточно четкое разделение саркоплазматических и миофибриллярных белков;

- длительность процесса электрофоретического фракционирования;

- возможность фракционирования только белков свинины.

Задачей изобретения является улучшение разделения белковых зон мясных экстрактов, уменьшение длительности процесса электрофракционирования и унификации исследований различных видов и качественных групп мяса.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в известном способе экстракции и разделения саркоплазматических и миофибриллярных белков мяса на фракции методом одномерного электрофореза в полиакриламидном геле, заключающемся в экстракции белков путем гомогенизации и центрифугирования образцов мяса в буферах-экстрагентах и последующем фракционировании полученных экстрактов в концентрирующем и разделяющем полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в электродном буфере, согласно изобретению проводят экстракцию саркоплазматических белков, используя буфер-экстрагент pH 7,6, в состав которого входит 0,3 М сахароза, 0,05 М этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 0,15 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), а для экстракции миофибриллярных белков используют буфер-экстрагент pH 7,6 в состав которого входит 0,05 М этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 0,15 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), с последующим диализом экстракта миофибриллярных белков против раствора pH 7,8, содержащего 0,6 М хлорид калия (KCl) и 0,1 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), после этого проводят электрофракционирование экстрактов саркоплазматических и миофибриллярных белков в 5% концентрирующем и 11% разделяющем полиакриламидном геле при напряжении 90 В на концентрирующий гель и 300 В на разделяющий гель в течение 2-2,5 часов.

Разработанные условия экстракции с использованием 0,3 М сахарозы 0,05 М EDTA, 0,15 М Трис, pH 7,6 и 0,05 М EDTA, 0,15 М Трис, pH 7,6 позволяют полностью экстрагировать саркоплазматические и миофибриллярные белки свинины и говядины из исследуемого материала. Хорошая экстракция дает возможность получить более четкое и воспроизводимое разделение белковых зон мясных экстрактов, чем при использовании распространенных способов экстракции, например, с использованием неионных детергентов и хаотропов (мочевина, гуанидиния хлорид), а также позволяет отказаться от нагрева пробы перед анализом.

Проведенными исследованиями установлено, что при использовании 5% концентрирующего геля при напряжении 90 В и разделяющего 11% геля при напряжении 300 В улучшается подвижность белковых макромолекул, а также уменьшается время электрофоретического фракционирования. Это происходит за счет уменьшения плотности геля и усиления напряжения, приходящегося на гель. Таким образом, подобранные условия являются оптимальными для электрофоретического разделения белков мяса.

Пример. Два грамма измельченного на часовом стекле мяса гомогенизировали в 5 мл 0,3 М сахарозы 0,05 М EDTA, 0,1 М Трис, pH 7,8. Экстракт перемешивают в течение 1 ч при 4°C на шейкере, затем центрифугировали при 2500 об/мин при 4°C в течение 10 минут. Полученный в результате центрифугирования супернатант содержит саркоплазматические белки. Осадок ресуспендировали в 5 мл 0,05 М EDTA, 0,15 М Трис, pH 7,6, перемешивали в течение 10 минут при 4°C, гомогенат фильтровали через три слоя марли, чтобы удалить остатки соединительнотканного белка. Неочищенный миофибриллярный белок очищали путем диализа против раствора pH 7,8, содержащего 0,6 М хлорид калия (KCl) и 0,1 М трисгидроксиметиламинометан (Tris). Каждый очищенный миофибриллярный белок центрифугировали при 2500 об/мин при 4°C 10 минут. Окончательно миофибриллярные белки растворяли в 0,6 М KCl, 0,1 М Трис, pH 7,8. Миофибриллярные и саркоплазматические белки хранят при -18…-20°C.

Готовят блок-пластины полиакриламидного геля толщиной 1 мм, размером 125×125 мм, состоящие из 11% разделительного геля высотой 100 мм и 5% концентрирующего геля высотой 25 мм. В качестве состава для буфера нанесения используют - 1 М Трис-HCl, pH 6,8, 10%-ный раствор DS-Na, глицерин, вода, 2-мсркаптоэтанол и 0,5%-ный раствор бромфенолового синего. Буфер нанесения и экстракты белков наносят на гребенку с двадцатью ячейками и количестве 6 мкл каждого образца.

Электрофорез проводят в ТРИС-глициновом буфере pH 8,3. В качестве стандарта белков на гелевых пластинах с исследуемыми пробами используют коммерческий препарат белков с известными молекулярными массами.

Прибор для электрофореза с нанесенным белком и камерами, заполненными электродным буфером, устанавливают в холодильник и подключают к источнику питания в соответствии с инструкцией. Устанавливают напряжение 90 В на гель 125×125×1 мм. Когда белок войдет в разделяющий гель, напряжение увеличивают до 300 В на пластину и поддерживают его на таком уровне до окончания электрофореза. Контроль за движением белка осуществляют по движению бромфенолового синего, который идет впереди белкового фронта. При описанном режиме электрофореза время деления белка составляет 2 часа.

По окончании электрофоретического разделения белков полученную гелевую пластину окрашивают раствором Кумасси R-250 в течение 15 мин. Отмывку геля от красителя проводят в уксусно-спиртовой смесь, завершают отмывку в 10% уксусной кислоте.

Отмытый гель фотографируют. На фиг.1 представлены электрофореграммы саркоплазматических (а) и миофибриллярных (б) белков говядины. На фиг.2 представлены электрофореграммы саркоплазматических (а) и миофибриллярных (б) белков свинины. Полученные электрофореграммы свидетельствуют о высокой разделяющей способности заявляемого способа.

Таким образом, заявляемый способ позволят улучшить разделение саркоплазматических и миофибриллярных белков, сократить длительность процесса электрофракционирования и дает возможность разделять саркоплазматические и миофибриллярные белки как свинины, так и говядины.

Похожие патенты RU2524546C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ПРОБОПОДГОТОВКИ БЕЛКОВ ДЛЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА 2013
  • Здрабова Екатерина Михайловна
  • Радченко Михаил Васильевич
RU2550135C2
Способ направленного истощения олигонуклеотидных библиотек для снижения неспецифической адсорбции при твердофазной селекции аптамеров на основе нуклеиновых кислот 2015
  • Рябко Алена Константиновна
  • Козырь Арина Владимировна
  • Колесников Александр Владимирович
  • Марьин Максим Александрович
  • Зенинская Наталья Алексеевна
  • Лисицкая Лидия Александровна
  • Шемякин Игорь Георгиевич
  • Дятлов Иван Алексеевич
RU2618872C1
Способ электрофоретического разделения саркоплазматических и миофибриллярных белков скелетных мышц животных 1973
  • Гунар Елена Валентиновна
  • Якубов Гелинард Завалунович
SU496045A1
Способ получения карбоангидразы 1981
  • Доман Николай Герасимович
  • Комарова Юлия Михайловна
SU955930A1
СПОСОБ ЭЛЕКТРОФРАКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 1995
  • Нарыжный Станислав Николаевич
RU2104082C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ТОКСИН-КОРЕГУЛИРУЕМЫХ ПИЛЕЙ АДГЕЗИИ И OmpU ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА 2006
  • Заднова Светлана Петровна
  • Еремин Сергей Александрович
  • Авдеева Наталия Георгиевна
  • Волох Оксана Александровна
  • Самохвалова Юлия Игоревна
  • Смирнова Нина Ивановна
RU2324740C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭСТРОГЕНСВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА, АССОЦИИРОВАННОГО СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ 2012
  • Булгаков Александр Александрович
  • Петрова Ирина Юрьевна
RU2489440C1
СПОСОБ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВМЫШЕЧНОЙ ТКАНИ 1972
SU421923A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА 1997
  • Пустошилова Н.М.
  • Килева Е.В.
  • Денисова Л.Я.
  • Шингарева Н.В.
  • Коробко В.Г.
  • Денисов Л.А.
  • Масычева В.И.
  • Сандахчиев Л.С.
  • Калинин Ю.Т.
RU2144958C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К БЕЛКАМ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК 2008
  • Фадеева Ирина Юрьевна
  • Евсеева Нина Васильевна
  • Селиванов Николай Юрьевич
  • Щеголев Сергей Юрьевич
RU2410395C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 524 546 C1

Реферат патента 2014 года СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ И РАЗДЕЛЕНИЯ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ И МИОФИБРИЛЛЯРНЫХ БЕЛКОВ МЯСА НА ФРАКЦИИ МЕТОДОМ ОДНОМЕРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Изобретение относится к биологии, в частности к биохимии и молекулярной биологии, и может найти применение при разделении саркоплазматических и миофибриллярных белков мяса на фракции в полиакриламидном геле. Способ заключается в экстракции белков путем гомогенизации и центрифугирования образцов мяса в буферах-экстрагентах и последующем фракционировании полученных экстрактов в концентрирующем и разделяющем полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в электродном буфере. Экстракцию саркоплазматических белков проводят с использованием буфер-экстрагент pH 7,6, в состав которого входит 0,3 М сахароза, 0,05 М этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 0,15 М трисгидроксиметиламинометан (Tris). Для экстракции миофибриллярных белков используют буфер-экстрагент pH 7,6, в состав которого входит 0,05 М этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 0,15 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), с последующим диализом экстракта миофибриллярных белков против раствора pH 7,8, содержащего 0,6 М хлорид калия (KCl) и 0,1 М трисгидроксиметиламинометан (Tris). После этого проводят электрофракционирование экстрактов саркоплазматических и миофибриллярных белков в 5% концентрирующем и 11% разделяющем полиакриламидном геле при напряжении 90 В на концентрирующий гель и 300 В на разделяющий гель в течение 2-2,5 часов. Способ позволят улучшить разделение саркоплазматических и миофибриллярных белков, сократить длительность процесса электрофракционирования и дает возможность разделять саркоплазматические и миофибриллярные белки свинины и говядины. 2 ил., 1 пр.

Формула изобретения RU 2 524 546 C1

Способ экстракции и разделения саркоплазматических и миофибриллярных белков мяса на фракции, заключающийся в экстракции белков путем гомогенизации и центрифугирования образцов мяса в буферах-экстрагентах и последующем фракционировании полученных экстрактов в концентрирующем и разделяющем полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в электродном буфере, отличающийся тем что, для экстракции саркоплазматических белков используют буфер-экстрагент pH 7,6, в состав которого входит 0,3 М сахароза, 0,05М этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 0,15 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), а для экстракции миофибриллярных белков используют буфер-экстрагент pH 7,6, в состав которого входит 0,05 М этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 0,15 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), с последующим диализом экстракта миофибриллярных белков против раствора pH 7,8, содержащего 0,6 М хлорид калия (KCI) и 0,1 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), после этого проводят электрофракционирование экстрактов саркоплазматических и миофибриллярных белков в 5% концентрирующем и 11% разделяющем полиакриламидном геле при напряжении 90 В на концентрирующий гель и 300 В на разделяющий гель в течение 2-2,5 часов.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2014 года RU2524546C1

Приспособление для разматывания лент с семенами при укладке их в почву 1922
  • Киселев Ф.И.
SU56A1
пер
ВНИИМП
Прибор для нагревания перетягиваемых бандажей подвижного состава 1917
  • Колоницкий Е.А.
SU15A1
Способ электрофоретического разделения саркоплазматических и миофибриллярных белков скелетных мышц животных 1973
  • Гунар Елена Валентиновна
  • Якубов Гелинард Завалунович
SU496045A1
WO 2012148490 A2, 01.11.2012
СПОСОБ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВМЫШЕЧНОЙ ТКАНИ 1972
SU421923A1
Устройство для выделения белков из биологических тканей 1989
  • Сердюк Александр Иванович
  • Молоканов Владимир Алексеевич
SU1693038A1

RU 2 524 546 C1

Авторы

Шалимова Оксана Анатольевна

Чернуха Ирина Михайловна

Радченко Михаил Васильевич

Здрабова Екатерина Михайловна

Даты

2014-07-27Публикация

2013-02-12Подача