Способ определения канцерогенных для кишечника химических веществ Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 

(S) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАНЦЕРОГЕННЫХ

ДЛЯ КИШЕЧНИКА ХИМИЧЕСКИХ Изобретение относится к медицине, а именно, к способам первичной оценки канцерогенной активности при массовых биологических испытаниях химических соединений. Известен способ определения канцерогенных для кишечника химических веществ путем введения испытуемого вещества опытной группе животных с последующим исследованием области ки шечника f 1 J. Однако при использовании известного способа для определения канцерог нной .активности химических веществ требуется от 1 до 3 лет и 300«00 животных, а также большое количество испытуемого химического вещества, при этом способ трудоемок, дорог и не может применяться при массовых испытаниях химических веществ. Целью изобретения является ускорение способа. Эта цель достигается тем, что согласно способу определения канВЕЩЕСТВцерогенных для кишечника химических веществ путем введения испытуемого Вещества, опытной группе животных и последующим исследованием области кишечника, после введения испытуемого вещества исследуют участок ки- шечника, при этом надевают его на цилиндрический стержень и вращают в физиологическом растворе в течение 59-61 с со скоростью 29503050 об/мин далее подсчитывают число выделенных при вращении стержня эпителиальных клеток и по снижению их числа в опытной группе по сравнению с контролем определяют жцерогенные для кишечника химические вещества. Способ осуществляют следующим образом. Раствор канцерогена и его растворитель вводят подкожно однократно двум группам мышей - опытной и контрольной, соответственно. Спустя 8-12 дней извлекают участок кишечника, выворачивают его эпителием наружу, одевают на цилиндрический стер жень диаметром 2, мм, стержень с тканью приводят во вращение влечение 59-61 с со скоростью 295030 50 об/мин внутри кюветы с внутренним диаметром 6,,б1 мм и объемом ,,55 мм, наполненной 0,9.1,1 мл физиологического раствора, taK, что осуществляют выделение клеток только из зоны слущивания, подсчитывают выделение при вращении стержня с тканью клетки и о канцерогенности вещества судят по снижению числа выделенных клеток в опытной группе ышей по сравнению с контрольной. Увеличение скорости вращения, уменьшение диаметра кюветы и уменьшение ее объема приводит к отры ву клеток из тех зон, которые не характеризуют клеточные потери в эпите лии кишечника, что приводит к ошибоч ным результатам о канцерогенной активности химического вещества, а уве личение указанных параметров снижает чувствительность способа. При мер. Выделение клеток при действии кишечного канцерогена 1,2-диметилгидразина (ДМГ), его ртруктурных неканцерогенных аналогов фенилгидразина (ФГ) и гидразинсульфата (ГС), и сильных канцерогенов,. не вызывающих опухолей в кишечнике уретана, орто-аминоазотолуола ОААТ 7,12-диметилбенз(а)антрацена (ДМБА). ДМГ выбирается по следующим признакам: ДМГ индуцирует опухоли при введении в малых дозах, не требует спец альной схемы введения, вызывает опухоли у 100 животных, не требует специальных сенсибилизирующих воздей ствий на экспериментальных животных. Из всех групп киигечных канцерогенов человек наиболее часто сталкивается с этой группой канцерогеноЬ. Струкtypныe неканцерогенные аналоги берут в той же дозе, что и ДМГ. Другие сильные канцерогены, не вызывающие опухолей в кишечнике, но индуцирующи опухоли в других тканях: уретан (в легких), ОДАТ (в печени), ДМБА (а месте введения - под кожей) в концентрациях, при которых они вызывают опухоли - 200 мг/кг веса тела и 50 мг/кг веса тела, соответственно. Мышей линии BAU В/с, самок в воз расте 15 недель делят на две группы. Опытной группе вводят подкожно ДМГ, растворенный в физиологическом растворе (рН доводят 1и, NaOH до 7,), в дозе 16 мг/кг веса тела мыши. Второй группе, контрольной вводят физиологический раствор с ,t из расчета 0,1 МП на 10 г веса тела мыши. Спустя 10 дней после введения ДМГ и физиологического раствора, обе группы мышей забивают, извлекают кишечник и определяют число выделяющихся клеток при принудительном отрыве. Принудительный отрыв клеток осуществляют в измерительной ячейке следующим образом. Промытый участок кишечника длиной 0,9-1.1 см выварачивают эпителием наружу, одевают на стальной стержень диаметром 2,96-3,06 мм, закрепляют на нем двумя лигатурами сверху и снизу, отступя 1 мм от края отрезка к его середине, и приводят во вращение в течение 59-61 с со скоростью 2950-3050 об/мин внутри кюветы с внутренним диаметром 6,59-6,61 мм и объемом 1,5-1,55 см, наполненной 0,9-1,1 мл физиологического раствора. Вращение осуществляется в течение 59-61 с с указанным числом оборотов, время разгона и остановки двигателя не учитывается. Выделенные клетки попадают в раствор, где подсчитываются с помощью камеры Горяева. Перечисленные операции повторяют для всех указанных веществ. Результаты показывают, что только ДМГ вызывает длительное снижение выделения клеток из прямой кишки. Длительное устойчивое снижение выделения клеток наблюдается только в отрезке прямой кишки, т.е. там, где отмечается наибольшая частота опухолей, возникающих, под действием этого канцерогена. В нисходящем отделе толстой кишки и в тонкой кише выделение клеток достоверно не отличимо от контроля и частота опухолей в толстой кишке резко снижена по сравнению с прямой кишкой. Неканцерогенные структурные аналоги ДМГ, ФГ и ГС достоверно не влияют на выделение клеток из отрезка прямой кишки и не вызывают опухолей в кишечнике. Канцерогены, не вызывающие опухолей в кишечнике, не снижают выделение клеток из .отрезка прямой кишки. Таким образом, обнаружена,.что ДМГ может вызывать снижение клеточных потерь что само по себе достаточно для роста новообразований в кишечнике. Действие ДМГ специфично: оно проявляется только в том участке кишечника, где ДМГ индуцирует опухоли.

Другие вещества, не являющиеся кишечными канцерогенами, таким эффектом не обладают.

Предлагаемый способ позволяет ускорить опр1еделение канцерогенных для кишечника химических веществ до 8-12 дней, при этом для испытаний требуется около 15-20 животных.

Предлагаемый способ повышает надежность получаемых результатов и более экономичен. Формула изобретения Способ определения канцерогенных для кишечника химических веществ 70 путем введения испытуемого вещества опытной группе животных с последующим исследованием области кишечника, отличающийся тем, что, с целью ускорения хпособа, после введения испытуемого вещества исследуют участок кишечника, при этом надевают его на цилиндрический стержень и Вращают в физиологическом растворе а течение 59-61 с со скоростью 2950-3050 об/мин, далее подсчитывают число выделенных при вращении стержня эпителиальных клеток и по снижению их числа в опытной группе по сравнению с контролем определяют канцерогенные для кишечника химические вещества. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Шабад Л.М.Методы определения изучения бластомогенности химических веществ. М., Медицина, с. 3, 1970.