Способ стабилизации декстраназы реNIсILLIUм FUNIсULоSUм Советский патент 1982 года по МПК C12N9/46 C12N9/96 

(54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ДЕКСТРАНАЗЫ PENICILLIUM FUNICULOSUM

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в медицине при получении препаратов декстраназы. Декстраназы применяются в стоматологии для профилактики кариеса зубов, для получения клинического декстрана путем частичного гидролиза высокомолекулярного декстрана, а также для изучения структуры полисахаридов, содержащих в своем составе ot-1,6 гликозидные связи. Известны способы стабилизации декстраназы, входящей в состав зубной пасты, зубных порошков, путем внесения стабилизирующих добавок, например желатины и пептона в количестве 0,3-3%. Добавление этих стабилизаторов сохраняло активность фермента на 80-89% в течение 3 мес хранения при температуре 30°С 1. Известен также способ стабилизации декстраназы путем добавления стабилизаторов-активаторов декстраназы в виде солей MgCb, которые вносят в пасты в количестве 0,1-0,3%. При этом фермент сохраняет свою активность на 86% в течение 9 мес. Добавление солей МпСЬ и СаСЬ активирует фермент в 5-14 раз. Таким образом, ионы , Са и стабилизируют и активируют декстраназу в составе зубных паст 2. Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ стабилизации декстраназы Penicillium funiculosum, основанный на использовании стабилизирующих добавок путем сорбции фермента на бентоните при рН 3,5-4,5 с последующей промывкой и элюцией фермента с сорбента при рН 8,0-8,2 0,1%-ным раствором стабилизатора, в качестве которого используют полиглюкин или продукт его гидролиза, глюкозу, мальтозу, лактозу, маннит или сульфат аммония. Полученный элюат лиофилизируют в присутствии стабилизатора (при концентрации последнего 0,2%). Бентонит обычно используют в количестве 2-3%. В качестве исходного ферментного раствора обычно используют ферментный концентрат, полученный осаждением фермента сульфатом аммония (70%) из культуральной жидкости Реп. funiculosum с последующим перерастворением осадка в воде 2. Недостатком известного способа является то, что препарат очищенной декстраназы.

полученный после десорбции ее с глины и лиофилизации в присутствии углеводов, добавляемых в известном способе для сохранения активности при лиофилизации, оказывается недостаточно стабильным при длительном хранении. При хранении такого препарата в течение 12 мес наблюдается потеря активности на 30-50/о.

Целью изобретения является удлинение сроков хранения декстраназы без потери активности.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу стабилизации декстраназы Реп. funiculosum, который предусматривает сорбцию фермента на бентоните при рН 3,54,5, отличительным признаком которого является то, что полученный сорбат обрабатывают 10-25°/о-ным раствором этанола в воде.

Бентоннт обычно используют в количестве 2-30/0.

Способ осуществляется следующим образом.

Раствор декстраназы, например в воде, полученный из культуральной жидкости Реп. funiculosum после концентрирования и осаждения сульфатом аммония и растворения осадка в воде, обрабатывают бентонитовой глиной в количестве 2-3%. Глину с адсорбированной на ней декстраназой отделяют от раствора и промывают водным раствором этанола, концентрация которого составляет от 10 до 25%. Глину с ферментом отделяют от избытка водного спирта и помещают на хранение в герметически закрытую тару. Измерение сухого остатка, проведенное методом доведения до постоянного веса, показало, что он составляет 40-50°/о от веса влажного материала, заложенного на хранение.

Фермент сохранял полную активность только при хранении его в адсорбированном состоянии в присутствии влаги в герметически закрытой таре. Определение количества влаги показало, что оно составляет 50-бО /о. Установлено, что длительность хранения существенным образом зависит от стабилизирующих добавок. Всего испытано 14 составов смесей (таблица), указанных в примерах, и найдено, что добавки этанола наилучщим образом влияют на стабильность декстраназы при хранении. Одинаково положительные результаты получены для концентраций этанола 10 и . Срок хранения фермента в сорбированном состоянии составил 1 год без потери его активности. Примеры 1--14. К 260 мл раствора декстраназы Реп. funiculosum с активностью 136 ед/мл добавляют 7,8 г (3°/о) глины «Аскангель, устанавливают рН - 4,0 добавлением нескольких капель 50%-ной уксусной кислоты. Смесь перемещивают 2 ч. Глину отделяют от раствора центрифугированнем, супернатант содержит 22,4% активности, не адсорбированной на глине. Глину с оставшимся на ней ферментом (77,6% от исходной активности) промывают водным раствором разных веществ (названия и концентрации веществ приведены в таблице). Промывание осущ.ествляют следующим образом. К одному грамму влажной глины прибавляют 10 мл водного раствора стабилизирующей добавки рН 4,5, перемещивают 1 мин, смесь центрифугируют в течение 5 мин при

6000 об/мин, супернатант отбрасывают, а влажную глину с ферментом помещают в полиэтиленовую пробирку, плотно закрывают резиновой пробкой для герметизации.

Через 12 мес.хранения во всех пробах был

определен сухой вес глины с адсорбированной на ней декстраназой и определена активность фермента в пересчете на сухую глину. Данные приведены в таблице.

Для сравнения был приготовлен препарат по известному способу и оставлен на храиение. Активность в этом препарате через 12 мес хранения составляла 60% от исходной.

Из таблицы видно, что в составах, где в качестве стабилизатора присутствует этиловый спирт в количестве 10 и 25% (пример 1, 2, 4 и 8) активность фермента сохраняется значительно лучще, чем в смесях, где стабилизаторы используются без добавления спирта (пример 5, 6, 9 и 10). При обработке глины с адсорбированным на ней ферментом 10 и 25%-ным этанолом активность декстраназы сохраняется . полностью в течение 12 мес хранения.

Технико-экономическая эффективность предлагаемого способа заключается в том, что он позволяет повысить сроки хранения

без потери активности от 6 до 12 мес.

Формула изобретения

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

3.Максимов В. И., Данилова Т. И. Хасирджева А. К. и Молодова Г. А. Стабилизация препаратов декстраназы Реп. funiculosum и FUsarium solani при нагревании и лиофилизации. Прикладная биохимия и микробиология, 1979, XV, вып. 6, 846-851.