Способ стабилизации протеазы BacILLUS SUвтILIS Советский патент 1990 года по МПК C12N11/00 C12N9/96 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения нерастворимых ферментных комплексов, и может быть использовано в микробиологической промьшшенности, медицине и ветеринарии.

Цель изобретения - увеличение ста бильности препаратов иммобилизованной протеазы при хранении.

Препарат протеазы из Bacillus sub- tills, иммобилизованной на активированной 2,4,6-трихлор-2,3,5-сим-три- азином (ТТ) целлнхпозной матрице, промывают 0,1-1,0 М водным раствором солей органических кислот общей формулы

К-(ССОМ)„, где R - С ,-С -остаток:

М - щелочный или щелочно-земельный металл;

п 1 или 2 (например, ацетаты натрия, кальция или магния, пропионат натрия, валерат натрия, глутаминат натрия, сукцинат натрия и др.). Промывку повторяют до исчезновения белка в промывных водах. Препарат.

оо. со

о

хранят при 4-6°С в виде 10-30%-ной суспензии в 0,1 М NaCl. Во время промывки используют стабилизирующие добавки в виде 0,1-1,0 М растворов органических кислот щелочных или ще лочно-земельпых металлов.

Значительное увеличение стабильности иммобилизованной протеазы достигают за счет сорбции анионов кисло

ты, обладающих буферной емкостью на поверхности частиц микрокристаллической целлю позы. После иммобилизации протеазы на носителе остается некоторое количество активного хлора. При хранении препарата протекает медлен- ньй процесс сольволиза, приводящий к локальному и общему понижению рН

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения нерастворимых ферментных комплексов, и может быть использовано в микробиологической промышленности, медицине и ветеринарии. Цель изобретения - увеличение стабильности препаратов иммобилизованной протеазы при хранении. Способ заключается в том, что препарат протеазы из BAC.SUBTILIS-65, иммобилизованной на активированной 2,4,6-трихлор-1,3,5-симтриазином целлюлозной матрице, промывают 0,1-1,0 М водным раствором солей органических кислот общей формулы R-(COOM)_N, где R - остаток, содержащий 1-4 углеродных атомов

М - щелочной или щелочно-земельный металл

N=1 или 2 (например, ацетаты натрия, кальция или магния, пропионат натрия, валерат натрия, глутаминат натрия, сукцинат натрия и др.). Промывку повторяют до исчезновения белка в промывных водах. Препарат хранить при 4-6°С в виде 10-30%-ной суспензии. После хранения в течение 24 мес сохраняется 45-80% активности. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

целлюлоза

Ьм

NOV-MH(D J

ы

се

Инактивация нейтральной протеазы в кислой среде протекает с более высокой скоростью, поэтому понижение рН ухудшает стабильность иммобилизованного препарата. Результаты исследования стабильности иммобилизованной протеазы при длительном хранении (табл. 1) показывают, что специфическая сорбция анионов стабилизирующих добавок является р ешающим фактором увеличения стабильности. Промывка иммобилизованных препаратов буферным растворами другого состава не оказывает стабилизирующего действия (табл. 1, опыты 11 и 12).

Использование катионов щелочных металлов в составе стабилизирующих добавок также оказывает положительное влияние на стабильность иммобилизованной протеазы. Это можно объяснить тем, что растворы солей щелочноземельных металлов повышают протеоли тическую активность как нативного, так и иммобилизованного фермента. Для иммобилизованной формы фермента этот эффект значительно более вьфа- жен, чем для нативного препарата. Стабилизирующий эффект добавок .понижается с увеличением неполярного остатка R, поэтому предпочтительными стабилизирующими добавками являются ацетаты.

При использовании стабилизирующих добавок в концентрациях менее 0,1 М стабильность препаратов постепенно понижается. Применение добавок в концентрациях, превьпиающих { ,0 М экономически невыгодно, поскольку увеличение стабилизирующего эффекта не наблюдается.

Полученные препараты иммобилизованной протеазы из В. subtilis обцеллюлоза

6

h +нсе

V-N

ладают высокой стабильностью при хранении во влажном состоянии. Способность препарата эффективно удалять некротические ткани и гнойную массу с раневой поверхности сохраняется по истечении 2,5 лет хранения. Препарат в виде мелкодисперсной суспензии можЙо наносить тонким, однородным слоем, вводить внутриполостно с помощью иглы или катетера. При применении иммобилизованного препарата или лечении гнойно-некротических ран сокращается

срок лечения больного на 4-9 дн. До- бавки не оказывают заметного влияния на стабильность нативного фермента. Растворы нативного фермента в условиях опыта полностью теряют активность

при хранении в течение 1 мес. Более выраженный эффект наблюдается только для солей щелочно-земельных металлов (табл. 1, опыт 13), катионы которых подавляют автолиз металлопротеаз.

Пример 1. Стабилизация иммобилизованной протеазы 0,1 М ацетатом натрия.

- Целлюлозный порошок (10 г) суспендируют в 100 мл 0,1 М боратного буфеР РИ 9,2), охлаждают до 15 С, добавляют 1 г ТТ, растворенного в 50 мл ацетона, и перемешивают 15 мин. Смесь фильтруют и дважды промывают смесью ацетона с водой (1:1). Осадок суспендируют в 50 мл 0,1 М боратного буфера (рН 8,5) и добавляют 100 ип раствора протосу бтилина ГЗх (штамм В. Subti- lis-65). Перемешивают 4ч при 15°С. Полученный продукт промывают 0,1 М раствором ацетата натрия (порциями до 50-75 мл) до исчезновения белка в промывных водах. Получают 9-9,6 г продукта (в пересчете на сухое вещество) . Хранят-в виде 20%-ной суспен

зии в 0,1 М NaCl при в течение двух лет.

Пример 2. Стабилизация иммобилизованной протеазы 0,5 М ацетатом кальция..

Препарат иммобилизованной протеазы получают по примеру 1, промывают 0,5 М раствором ацетата кальция, хранят в виде 20%-ной суспензии в 0,1 М NaCl при в течение двух лет.

Пример 3. Стабилизация иммобилизованной протеазы 1,0 М ацетатом магния.

15

Препарат иммобилизованной протеазы получают по примеру 1, промывают 1,0 М раствором ацетата магния (50 мл) и хранят в виде 20%-ной суспензии в 0,1 М NaCl при 4-6 С в течение двух лет.

.Пример 4. Стабилизация иммобилизованной протеазы 0,075 М ацетатом натрия.

Препарат иммобилизованной протеа получают по примеру 1, промывают 0,075 М раствором ацетата натрия и хранят в виде 20%-ной суспензии в 0,1 М NaCl при 4-6 С в течение двух

лет..

/

Пример 5. Стабилизация иммобилизованной протеазы 1,25 М ацетатом магния.

Препарат иммобилизованной протеа зы получают по примеру 1, промывают 1,25 М раствором ацетата магния и хранят в виде 20%-ной суспензии в 0,1 М NaCl в течение двух лет.

Данные по изучению протеолитичес кой активности препарата по примеру 1-5 приведены в табл. 1.

Пример 6. Стабилизация иммобилизованной протеазы 0,5 М ацетатом кальция.

597390 ;6

Препарат иммобилизованной протеазы получают по П1..имеру 1 , применяя раствор протосубтилина ГЗх из штамма В. subtilis-103. Промывают 0,5 М раствором ацетата кальция, хранят в виде 20%-ной суспензии в 0,1 М NaCl при 4-6 С в течение двух лет.

Пример 7. Стабилизация им- Q мобилизованной протеазы 0,5 М ацетатом натрия.

Препарат иммобилизованной протеазы получают по примеру 1, применяя раствор протосубтилина ГЗх из штамма 15 В. subtilis 1-1. Промьшают 0,5 М раствором ацетата-натрия, хранят в виде 20%-ной суспензии в 0,1 М NaCl при 4-6°С в течение двух лет.

Данные по изучению протеолитичес- 20 кой активности препарата по примерам 6 и 7 приведейы в табл, 2.

Формула изобретения

К-(СОСМ)„, где R - С-(-С -остаток;

М - щелочной или щелочно--земельный

металл; п 1 или 2.

Таблица 1

1597390

За 100% принимается активность препарата перед обработкой стабилизирующими дoбaвкa и. , Нативный фермент хранят в 0,1 М ацетата кальция.

Таблица- 2

Продолжение табл. I