Способ получения иммобилизованной дрожжевой алкогольдегидрогеназы Советский патент 1983 года по МПК C12N11/14 C12N9/04 

ел

СП

со сл Изобретение относится к способам иммобипизации ферментов, к частности к попучениюгетерогенных катализаторов на неорганических аоситепяк. Известен способ получения иммобипизованной апкогопьцегицрогеназы (АДГ) путем ее ацсорбции на широкопористом сипикагепе, моцифицированном апьбуми ном i . Оцнако данный способ не обеспечивает высокой стабильности иммобипизованной апкогопьцегицрогенаэы. Наиболее близок к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту способ получени иммобилизованной дрожжевой алкогольцегидрогеназы путем ее адсорбции на pt, - окиси-алюминия при рН 8,О-9,О ; последующей обработкой конденсирующим реагентом напримерглутаровымальдегицом 12 . Иммобилизацию фермента проводят на oL -окиси алюминия типа 5АЕН5За из водных растворов при 25®С. Параметры сорбента - удельная поверх- кость 4 .средний диаметр пор л- 10ОО Размер пор носителя не соответ ствует размеру молекулы фермента. Следовательно, в порах этого носителя не происходит многоточечного) связывацтля фермента вспецствие отсутствия так называемого станочного эффекта. Поверх ность Л -окиси алюминия характеризуется наличием слабых кислотно-основных центров, которые связывают фермент, и низкой ик концентрацией. Поэтому иммобилизованная на таком носителе апкогопьдегидрогеназа имеет низкую стабиль ность. Обработка гпутаровым альдегидом не приводит к значительному увепичению стабильности препарата. Активность препарата 3-5 ЕА/г, время полной дезакти вации от 5 до 7 дн. Недостатком известного способа яв- пяется низкая-стабильность препарата иммобипизованного фермента. ; Цель изобрёгения - увепиченне стабильности ферментного препарата. Указанная цепь достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованной дрожжевой алкогольдегидроген&аы путем ее адсорбции на окиси апаоминня при рН 8,О-9,О с последующей обработкой конценснруюшям реагентом аасор ню проводят на 0 -или у ок ся1и апюмвния. Обычно в качестве конценсирующего реагента используют глутарбвый альцегид в концентрации 0,1% или карбодиимид в концентрации 2,5%. Низкотемпературные формы окиси алюминия 0 , у обладают, во-первых оптимальной пористой структурой, во-вторых, достаточной концентрацией и силой кислотно-основных центров на поверхности. Дополнительное увеличение стабильности достигается обработкой адсорбированного фермента конденсирующими агентами (глутаровым альдегидом, карбодиимидом). Использованный в способе носитель окись агдаминия, является крупнотоннажным промышленным продуктом, дешевым и доступным. Этот носитель имеет легко регулиру&мую пористую структуру, что является чрезвычайно важным для иммобилизации ферментов. Предлагаемый способ заключается в следующем. Навеску носителя (25 мг) дезаэрируют, заливают 2 мл буферного раствора фермента и проводят адсорбцию фермента при комнатной температуре до достижения адсорбционного равновесия (2 сут). По разности количеств АДГ в исходном и равновесном растворе рассчитывают количество адсорбированного фермента. Затем аасорбированную алкогольдегидрогеназу обрабатывают 0,1% глутаровым альдегидом (0,1%) или карбодиимицом в концентрации 2,5 % в течение 30 мин. при комнатной температуре. Активность иммобилизованного фермента измерзпот в циркуляционной установке с дифференциальным безградиентным реактором, термостатируемым при . Скорость ферментативной реакции определяют спектрофотометрически по появлению НАС Н, имеющего полосу поглощения при 340 нм. Стабильность иммобилизованной алкогольдегицрогеназы определяют при хранении в буферном растворе при комнатной температуре, периодически испытывая по лученный образец на активность. Потеря л 95% первоначальной активности считается полной дезактивацией иммобилизованной АДГ. Пример, Иммобилизация дрожж&вой алкогольдегидрогеназы на Q -окии алюминия & AE50q( аезаэрируют и заливают 2 мл буферного раствора апкогопьдегицрогеназы (0,05 М триобуфер, рН 8,0) в концентрации 70080О мкг АДГ/МП. Адсорбцию проводят при комнатной температуре п течсггие 2 сут. Максимальная вепичина ацсорбции цостигает 45 мг/г. Активность полученного образца 30 ециниц активности на г препарата (за единицу активности (ЕА) фермента принимают такое его копичестг во, которое восстанавливает 1 ммопь при 25°С (р-Н 8,О) и насыщающих концентрациях этанопа). При хранении полученной иммобипи зованной апкогопьцегицрогеназы в буферных растворах (0605 М трио-буфер, рН 8,0) и комнатной температуре фермент полностью дезактивируется за 5 нецель. П р и м а р 2, Иммобилизация црожжевой апкогопьдегицрогеназы на -окиси алюминия. Ацсорбцию фермента нау4е,ОД5ад 80«/ провоцят в условиях примера 1. Величина ацсорбции цостигает 46 мг/г активность - 2О ЕА/г препарата. Алкогольцегицрогеназа, ацсорбированная на таком носителе, поцностью теряет свою активность за 5 нацель хранения в триобуфере (рН 8,0) при комнатной темпера тура. Алкогопьдегицрогеназа, ацсорбирован- ная на облацает большей ста- бильностью по сравнению с ферментом, иммобилизованным Ha.oL ABjO В порах этих носителей АДГ связана нavIбoлee прочно и многоточечно вслецствие станоч ного эффекта. Ацсорбция алкогольаегиаро геназы на Q- к -окисях алюминия .увеличивает ее стабильность в сравнении с нативным ферментом: при хранении в . трис- буфере (рН 9) иммобилизованный фермент дезактивируется за 5 нецель, нативный - за 4 ан. Наблюдается оптимум стабильности в зависимости от ст&пени заполнения поверхности АДГ. Наибо лее стабильны образцы, в которых поверхность носителя покрыта полностью, когца мажбелковые взаимоцействия молекул цруг с другом стабилизируют фермен алкогольдегицрогеназы. Иммобилизованна (1 алкогольаегидрогеназа при хранении в пирофосфатном буфере(рН 9) и комнатной температуре полностью цезакт .вируется на 4 цн. Следовательно, . адсо{Ь бированная на Q « у /.( дрожжевая АДГ на порядок стабильнее. П р и м а р 3. Иммобилизация алко.гопьцагидрогеназы на д -окиси ашоми ния с последующей обработкой глутаровым альдегидом. Полученную в условиях примера 1 адсорбированную Ha9-A2.;0-j алкогольцегидрогеназа обрабатывают глутаровым альдегидом по следующей методике: концентрация глутарового альдегида О,1%, время сшивки 30 мин при комнатной температуре. Затем проводится восстановление образовавшихся оснований шиффа 20 мМ боргидридом натрия в течение 20 мин, при . При хранении в 0,05 М трио-буфере (рН 8,0) с добавлением 1 мМ ЭДТА и 1 мМ меркаптоэтанола в течение 1 мае. иммобилизованная алкогольдегидрогеназа (а 45 мг/г) сохраняет 9О -1ОО% первоначальной активности. Иммобилизованная алкогольдегидрогеназа, приготовленная таким способом, сохраняет 30-4О% первоначальной активности по истечении 9 мае. хранения при комнатной температуре и 80-100% - при хранении в холодильнике (). Обработка глутаровым альдегидом адсорбированной на - f(2,iO({sa 6 MVr) алкогольдегидроганазы приводит к незначительному увеличению стаг бильности иммобилизованного фермента: обработанная глутаровым альдегидом АДГ полностью дезактивируется за 11-12 дн. тогда как без обработки этим реагентом - за 3-5 дн. П р и м е р 4; Адсорбция комплекса фермент: кофермент или фермент - суб- страт HaQ-аДб Оз с последующей обра. боткой глутаровым альдагицом. На носитель Q -окись алюминия (5uQ 73 Mvr) адсорбируют комплекс, фермента с субстратом (этанолом) или кофармантом (ЦА)) в условиях примера 1, При этом активный центр фермев та, в который входят N Н -содержащие аминокислоты, защищается ет модифика- , ции глутаровым альдегидом, обладаю, щим сродством к активному центру . Последующую обработку комплекса глу- таровым альдегидом проводят по методике, описанной в примере 3. Попученная таким образом, иммобиггазованная алко гольдегидрогеназа (45 мг/г) попностью сохраняет свою активность по истечении 1 мае хранения при комнатной темперв туре (0,О5 М трио-буфер, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА; 1 мМ меркаптрэтаноп). ПримерЗо Иммобилизация црон жевой апкогопьдегицроганазы с поспецующей обработкой карбодиимидом, , Ацсорбированную на& A jU {6ue 7 ii/i) в усповиях примера 1 алкогопьдегицро$10геназу обрабатывают карбоциимицом fl - гакпогексип -д-(2-морфопиноэтип), -карбоциимицмето-4-топуопсуцьфонатомТ по спецующей метоцике: 2, раствором карбоцивмица (рН 8,0) сшивают мопекулы фермента цруг с цругом Ъри комнатной температуре в течение ЗО мин Лпя уцапения карбоциимиаа nociie реакции образец многократно промывают бицистиппированной воцой. Бпагоааря бопь шому размеру молекупы, карбоциимиа почти не затрагивает активный центр фермента. что позволяет получать более активный, чем в примере 3, препарат иммобилизованной алкогольаегиарогеназы. Активность АДГ, обработанной глу таровым альцегицом (пример 3), составляет 16 ЕА/г препарата, активность сшитта о карбоциимицом фермента 25 ЕА/ препарата, т. е. в 1,6 раз больше. Полученная такик образом алкогольцегицрогеназа { С| 25 мг/г) сохраняет 35 в течение 1 мес хранения в трис-буф&ре рН 8,О (с 1 мМ ЭДТА и 1 мМ меркаптоэтанолом) при комнатной температуре 95-10О% первоначальной активноо ти. Преимуществом аанного способа является высокая стабильность препаратов иммобиливованной црожжевой алкогольцегиарогеназы, полученных путем аасор цин путем ацсорбции фермента на 9,- у формах окиси алюминия с последующей обработкой конценсирующими агентами (глутаровым альаегиаом, карбоциимиаом), по сравнению с препаратами фермента, ацсорбированными на ei -.окиси алюминия. Высокая стабильность препарата я&.ляется важнейшей технологической характеристикой и позволяет использовать иммобилизованную алкогольцегицрогеназу в проточных реакторах с максимальной эффективностью.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ДРОЖЖЕВСЛ АЛКОГОЛЬ/ШГИДРОГЕНАЗЫ путем ее ацсорбг ник на окиси алюминияпрв рН 8,Ou9,O с поспеаующей о лботксЛ конаенснруюшим pf агентом, отпнчаюшийся тем, что, с цепью увеличения стабильности фе{ ментного препарата, ацссфбишо провооят на Of-или аяюмииия. 2. Способ по п. 1, о т я и ч а юш и и с я тем, что в качестве кондеисируюшёго реагента используют гпутаровый альдегид в коноентрацин О,1% или ка{ бсдаимнп в кояиентрации 2,5%. сл