Стабилизатор иммобилизованных сериновых протеиназ Советский патент 1993 года по МПК C12N11/14 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к средствам стабилизации ферментов, ферментных комплексов и полиферментных систем.

Цель изобретения - повышение стабильности и пролонгирование активности иммобилизованных ферментов, их комплексов и полиферментных систем.

Для достижения указанной цели предложено применение активированного углеродно-волокнистого материала в качестве стабилизатора иммобилизованных на том же материале сериновых протеиназ.

Выявление стабилизирующих свойств исследуемого материала является неочевидным решением. Впервые было отмечено и доказано существенное повышение стабильности и увеличение сроков хранения ферментов, иммобилизованных на активированном углеродно-волокнистом материале, при воздействии различных инактивирующих факторов: повышение температуры, лиофилизация, действие ингибиторов (соевого ингибитора трипсина, мочевины), стерилизация облучением и водяным паром. Следует также отметить, что к достоинствам нового средства относится возможность стабилизации не только отдельных протеиназ, но и ферментных комплексов и полиферментных систем.

Для доказательства новых свойств предложенного материала используют образцы активированного волокнистого углеродного материала двух марок: материал

00

00

ы

АУВМ с объемом пор 1,0 см /г, удельной поверхностью 1800 м2/г; материал УВА с объемом пор 0,8 см3/г, удельной поверхностью 1700 MVr.

Новые свойства предложенного материала иллюстрируются примерами конкретного применения и исследованиями, доказывающими новый положительный результат, который заключается в сохранении активности после обработки известными инактивирующими средствами.

П р и м е р 1. Иммобилизация трипсина на АУВМ.

Полоску АУВМ, площадью 1 см2, закрепленную на фиксаторах и предварительно уравновешенную физиологическим раствором, опускают в раствор трипсина. Объем реакционной смеси 5 мл на 1 см2 адсорбционного материала, исходная концентрация адсорбата - 100 мкг/мл. Иммобилизацию проводят в течение 150 мин. При определении активности иммобилизованного фермента или иммобилизованных комплексов протеолитических ферментов в качестве субстрата используют протамин сульфат (ПС). Матрицу АУВМ (1 см2) с иммобилизованным ферментом (закрепленным в держателях) погружают в 5 мл 1%-ного раствора ПС, рН 7,6. Субстрат гидролизуют 30 мин при 37°С. Реакцию прекращают, вынимая матрицу с иммобилизованным ферментом из раствора субстрата. Контрольный образец иммобилизованного фермента предварительно обрабатывают 30%-ным раствором трихлорукеусной кислоты в течение 30 мин. В гидролизате определяют количество свободных аминокислот. Активность иммобилизованного фермента определяют по разности в содержании свободных аминокислот при его действии на субстрат в контрольном и опытных образцах.

П р и м е р 1а. Иммобилизацию трипсина и определение активности иммобилизованного трипсина осуществляют по способу, описанному в примере 1, но в качестве стабилизатора используют полоску материала УВА площадью 1 см .

П р и м е р 2. Термообработка.

Для определения стабильности иммобилизованного на АУВМ трипсина матрицу с иммобилизованным трипсином помещают в сушильный шкаф при температурах 20- 100°С и выдерживают в течение 30 мин. После термообработки опытные образцы охлаждают и определяют активность иммобилизованного трипсина. После нагревания при 20-90°С иммобилизованный трипсин полностью сохраняет свою активность , а при 100°С его активность снижается на 6%

от исходной до термоинактивации. При аналогичных условиях нативный трипсин выдерживает нагревание до 30°С, при 40°С - сохраняется 73% исходной активности, при 50°С - 55%, при 60°С - 29%, при 65°С он полностью инактивируется.

П р и м е р 3. Действие соевого ингибитора трипсина.

Для определения стабильности им- 0 мобилизованного на АУВМ трипсина его обрабатывают растворами соевого ингибиторами трипсина.

При ингибировании соевым ингибитором активность иммобилизованного трип- 5 сина сохраняется.

Результаты опытов представлены в таблице.

При аналогичных условиях определяют стабильность нативного трипсина к дейст- 0 вию соевого ингибитора. При молярном соотношении нативный трипсин:соевый ингибитор 1:1 сохраняется 11% активности (по отношению к исходной до действия ингибитора); при соотношении 1:1,5 - 5% ак- 5 тивности, при действии соевого ингибитора на трипсин в соотношении 1:2 нативный трипсин полностью инактивируется.

П р и м е р 4. Лиофильное высушивание.

Образцы иммобилизованных на АУВМ 0 трипсина, комплекса протеолитических ферментов Acremonium chrysogenum, комплекса протеолитических ферментов Streptomyces grfseus, полиферментной смеси протеолитических комплексов Асг. 5 chrysogenum и Str. griseus, а также образцы иммобилизованных на УВА протеолитических комплексов Асг. chrysogenum и Str. griseus высушивают на установке LZ-9 в течение 3 ч.

0 4,1. Активность трипсина после лиофи- лизации не изменяется. Активность лио- фильно высушенного трипсина сохраняется в течение 15 мес хранения.

4.2. Активность иммобилизованного 5 комплекса Асг. chrysogenum после лиофили- зации сохраняется полностью. После 12 мес хранения при комнатной температуре активность лиофильно высушенного протео- литического комплекса Асг. chrysogenum 0 составляет 80% от исходной.

4.3. Активность иммобилизованного комплекса Str. griseus после лиофилизации сохраняется полностью. Активность лиофильно высушенного протеолитичевского 5 комплекса Str. griseus после 12 мес хранения составляет 85% от исходной.

4.4. Активность иммобилизованной полиферментной смеси протеолитических комплексов Асг. chrysogenum и Str. griseus после лиофилизации сохраняется полностью. После 12 мес хранения при комнатной температуре сохраняется 90% активности от исходной.

4.5. Активность иммобилизованных на УВА протеолитических комплексов Асг, chrysogenum и Str. grlseus после лиофили- зации сохраняется полностью. После 12 мес хранения при комнатной температуре активность лиофильно высушенного протео- литического комплекса Асг. chrysogenum составляет 75% от исходной. Активность лиофильно высушенного комплекса Str. griseus после 12 мес хранения составляет 70% от исходной.

П р и м е р 5. Действие мочевины. Для определения стабильности иммобилизованных на АУВМ комплексов протеолитических ферментов Асг. chrysogenum, Str. grlseus, а также иммобилизованного на УВА трипсина образцы АУВМ с иммобили- зованным комплексом протеолитических ферментов погружают на 60 мин в 5 мл раствора мочевины следующей концентрации: 1 М, 2М, ЗМ, 4М, 5М, 6М, а образцы УВА с иммобилизованным трипсином в 5 мл рас- твора мочевины концентрации: 1М, 2М, ЗМ, 4М, 5М, 6М.7М, 8М.

5.1. Активность иммобилизованного протеолитического комплекса Асг. chrysogenum последействия растворов мо- чевины полностью сохраняется.

5.2. При действии 1М-4М растворов мочевины активность иммобилизованного комплекса Str. griseus сохраняется полностью; после обработки 5М раствором моче- вины понижается на 8% по сравнению с исходной, после обработки 6М раствором - понижается на 14%.

5.3. Активность иммобилизованного на УВА трипсина после действия растворов полностью сохраняется.

П р и м е р 6. Стерилизация гамма-облучением трипсина.

Образцы иммобилизованного на АУВМ трипсина, сначала лиофильно высушивают (как описано в примере 4), а затем подвергают стерилизации гамма-облучением (доза ионизирующей радиации 2,5 Мрад). Для сравнения также подвергают гамма-облучению образцы нативного трипсина.

Активность иммобилизованного трипсина не изменяется после стерилизации,активность нативного трипсина снижается на 25%.

П р и м е р 7. Стерилизация гамма-облучением полиферментной смеси.

Образцы иммобилизованной на АУВМ полиферментной смеси Асг. chrysogenum и Str. grlseus сначала лиофильно высушивают, затем подвергают стерилизации гамма- облучением (доза ионизирующей радиации 2,5 Мрад). Для сравнения также подвергают стерилизации гамма-облучением образцы нативной полиферментной смеси.

При действии указанной ионизирующей дозы активность полиферментной смеси снижается на 25%. а нативная полиферментная смесь инактивируется.

Через 12 мес хранения активность лиофильно высушенной полиферментной смеси после стерилизации гамма-облучением составляет:

а) при 4°С хранения - 90% от исходной после гамма-облучения;

б) при 20°С - 85% от исходной;

в) при 50°С - 55% от исходной,

Примере. Стерилизация водяным паром полиферментной смеси.

Образцы иммобилизованной на АУВМ полиферментной смеси Асг, chrysogenum и Str. grlseus сначала лиофильно высушивают (как описано в примере 4). затем подвергают стерилизации водяным паром при 180°С. Для сравнения также подвергают стерилизации при указанных условиях образцы нативной полиферментной смеси.

Активность лиофильно высушенной полиферментной смеси после воздействия водяным паром снижается на 25%, а нативная смесь инактивируется.

Через 12 мес хранения активность лиофильно высушенной иммобилизованной полиферментной смеси, подвергнутой паровой стерилизации,составляет:

а) при 4°С хранения - 95% от исходной после паровой стерилизации;

б) при 20°С - 85% от исходной;

в) при 50°С - 60% от исходной.

Формула изобретения Применение активированного углеродно-волокнистого материала в качестве стабилизатора иммобилизованных на том же материале сериновых протеиназ.

Использование: биотехнология, в частности касается средств стабилизации ферментов, ферментных комплексов и полиферментных систем. Сущность изобретения: применение активированного углеродно-волокнистого материала в качестве стабилизатора иммобилизованных на том же материале сериновых протеиназ. 1 табл.