Способ приготовления питательной среды для культивирования микроорганизмов Советский патент 1979 года по МПК C12K1/06 

I

Настоящее изобретение относится к мик15обиологичёским исследования, в которых используют плотные питательные- среды, и может быть приме нено в диагностических и научных целях.

В микробиологической практика для получения плотных нитательных сред обычно используют следующие вещества: агар, силикагель, желатин, крахмал, кровь, сьшоротку крови, пектат натрия, мети.паделяголозу, белок и желток куриного яйца l-4j , :

Вольвшнстйб этих веществ в силу различных причйй (отсутствие универсальности непрозрачность, вы.сокая стоимость и др.) не нашли ишр кого применения.

Наиболее близким к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ приготовления питательной среды для культивирования микроорганизмов, заключающийся в одновременом получении полиакриламидного геля и прюпитке его питательным субстратом (получение полиакриламидного геля ведут в присутствии питательного субстрата) с последующей стерилизацией s .

Описанный способ имеет следующие недостатки: получаемые питательные среды содержат токсические вещества/ стерилизация этих сред затруднена, при их приготовлении могут быть использованы не любые питательные субстраты; питательные среды етлеют кислую реакцию (рН 3,5-4), что ограничивает возможность их использования.

С целью получения 5 нийёрсальных питательных сред, предложен способ приготовления питательной среды,

5 предусматривающий получение полиакриламидного геля, являющегося основойК- среды, и последующую пропитку его питательным субстратом до или после стерилизации.

Питательные среды на полиакрил- амидной основе микробиологически инертны, пригодны для культивирования различных классов микроорганиз5мов при рН 1-14, высокопрозрачны, прочны, эластичны, имеют гладкую поверхность, стерилизуются без изменения своих свойств, могут храниться в течение длительного време0ни. Предлагаемый способ приготовления питательной среды осуществляют следующим образом. Для достижения поставленной цели в качестве основы для плотных питательных сред используют пластины полиакриламидного гчэля. Для получения геля используют: тетраметилэтилдиамин, метилен бис-акриламид, акриламид, персульфат аммония, дистиллированную воду. Готовят 3 раствора : А, В, С. Приготовление раствора А:5 мл тетраметилэтилдиамина добавляют к 995 мл дистиллированной воды. Приготовление раствора В: к 350 дистиллированной воды, подогретой до 60°С,.добавляют 7,35 г метилен-бис-акриламида. После фильтрации через ватно-марлевый фильтр к данному, раствору добавляют 280 г акрил , который -тщательно размешивают. Полученный раствор повторно фильтруют через ватно-марлевый фильтр и добавляют к нему дистиллированную воду до 1000 мл. Приготовление раствора С; в 1000 мл дистиллированной воды растворяют 1,4 г персульфсчта аммония. Растворы А и В могут храниться в посуде из темного стекла при в течение месяцев. Раствор. С в таких же условиях сохраняет свою активность в течение 25-30 суток. Получение пластин полиакриламидного геля осуществляют .следующим образом. Из основных растворов готовят рабочую смесь путем последовательного смешивания одного объема раств ра А, двух объемов раствора В и четырех объемов раствора С, Приготовленную таким образом рабочую смесь заливают в щель заданно толщины, например, 2,5-3 мм, обра™ зованную двумя чястьми стеклами на подставках, площадью от 1 1 м и более и оставляют при естественн или искусственном осзегдении на 1520 мин. За это время происходи . полимеризация рабочей смеси. После полимеризащ-1и верхнее стекло снимаю а оставшуюся на нижнем ст.екле плас ну полиакриламидного геля делят на более мелкие пластины заданной форм и размеров, например, на круглые пластины диаметром 7, см„ Послед ние снимают со стекла и помещают в дистиллированную воду на 1,5-2 ч для отмывания (с трехкратной смено воды) С целью использования пластин п лиакриламидного геля в качестве ос для плотных питательных сред, отмы в дистиллированной воде пластины п питывают питательной средой. Для этого пластины помешают в жидкую п тательную среду, например, мясопептонный бульон, и выдерживают в 4 ней 1-1,5 час при комнатной температуре или 30 мин в термостате при 37°С, За эго время происходит полное насыщение пластин питательной средой (состав жидких питательнЕзК сред опрееляется видом исследуемых микроорганизмов) . После насыщения пластин питательной средой заданного состава их поещают в чашки Петри, стерилизуют паром под давлением или текучим паром {режим стерилизации определяется составом питательной среды), засевают исследуем лми микроорганизмами. ыращивание микроорганизмов осущестляют по Общепринятым методикам. Пластины полиакриламидного геля ля микрокультивирования микроорганизмов готовят толщиной 1,5-2 мм, разрезают на блоки заданной формы и размеров, например, квадратные, площадью примерно 1 см , отмывают в дистиллированной воде, стерилизуют паром под давлением, пропитывают стерильной жидкой питательной средой и используют для микрокультивирования. Эффективность питательных сред, где в качестве плотной основы были использованы пластины полиакрилс1мид ного геля,, испытывалась на музейных культурах следующих видов микроорганизмов : StaphyEococcus. aureus 209Р, Ml7, E.coBi Ki2, Sh. sonneif Sh.fEexneri, B.proteus f 1, B.proteus mirabigis , B.pyocuaneum I65j. B.cereus 8035, B. mesentericus 1027, B, subtiSis 83, B. roegatherium 654, Mycop2asma oraEi, Mycop&asma pneumoniae, Mycopfcasraa fermentans. Изучались характер роста, форма и размеры колоний, количество бТ5Омассы, выживаемость, морфологические, тинкториальные,биохимические и серологические свойства исследуемь&с микроорганизмов. С целью приготовления питательных сред для выращивания; Staphy&ococCU.S aureus 209,Eco6i M-17,E. соб К-12, Sh.sonnei,6h.iEexneri,S.T)oteuBff i.:&. proteus mirabiEis 56f iO,Bpyocyaneum i65,B.cepeu6 8035,15. mesenteHcu5;l027, B.Siibli8Js.83,B.megatherium 654 использовался мясо-пептонный бульон, Для приготовления, питатеа ьных сред для выращивания MycopSasrna ога й, MycopEasma рпецтопше, Mycop6asma ievmen tansиспользовались следующие компоненты триптический перевар сердечных мышц крупного рогатого скота с амигишм азотом 160-170 мл - 7 вес,ч., свежая нормальная Л9шадиная сыворотка без консерванта 2 вес,ч., све жни 25%-ный дрожжевой экстракт 1 вес,ч., пенициллин. - 500 ед на 1 мл сре.цы.

Вых ИБаемость исследуе -и х видов микроорганнзмо э изучалась путем посева 0,5 мл взвеси, содержащей 100 клеток исследуемого вида микроорганизма, взятого в фазе экспоненциального роста, на изучаемые среды с последующей инкубацией.

659619g

Каждый опыт ставят в трех повторнос т ях с последующим выведением средних величин по общепринятым методикам.

Результаты выживаемости исследуемых видов микроорганизмов представлены в табл.