Способ определения устойчивости хлопчатника к вилту Советский патент 1983 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к селекции на иммунитет к,болезням и может быть использовано в сельском хозяйств.е. Известен способ -определения устойчивостихлопчатника к вцлту, при котором перед посевом хлопчатника производят заражение:почвы возбудителем данного заболевания Ci. . Однако данный способ требует боль шик затрат времени и труда и не всег да приводит к желаемым результатам, так как Проявление заболевания в естественных условиях зависит от почвенйо-климатических условий. Изв эстен также способ определения устойчивости хлопчатника к вилту, пр котором проводят гибридизацию молеку ДНК, выделенной из хлопчатника с мечанной ДНК-С , полученной из возбудителя вилта хлопчатника и по степени гибридизации судят о степени устойчивости Г2.; Данный способ не позволяет получа неповрежденную ДНК из растений, а высокая гибридизуемость между ДНК хлопчатника и гриба затрудняет опредеде.ние вилтоустойчивости. Цель изобретения - ускорение опре делений вилтоустойчивости и повышение его точности. Поставленная цель достигается . тем, 4то проводится реакция аминоацетилирования тРНК-.ферментОм амино-. ацил-тРНК-синтетазы,выделенной на разных по устойчивости сортов и по заменяемости ферментов определяют степень устойчивости к заболеванию. Та- . КИМ образом проводят выделение тРНК из устойчивых к вилту сортов хлопчат- ника и аминоацил-тРНК-синтатазы - из неустойчивых и по заменяемости ферментов судят о степени устойчивости к заболеванию. Пр и м ер .100 г йамоченныз5.,в бидистиллированной воде семян растирают в ступке с 200 мл 0,05 М ацетат ного буфера, рН 7,0 содержащего 1мг/мл бентонита, 0,03 McgCPs 0,01Н меркаптоэтанола до гомогенной массы. Гомогентат центрифугируют 40 мин npir 20000 об/мин, к надо садочной .жидкости добавляют додецилсульфат натрия (5DS) до конечной концентраций О,5%-ной я равное количество водного фенола и перемешива|от при комнатной температуре-20 мин. Водную 4азу .отделяют цент рифугированием 10.мин. при 5000 об/мин, обрабатывают смесью хлороформ из6ами ловый спирт (24:1) и центрифугируют 5 мин при 5000 об/мин. Из водного

слоя осаждают РНК добавлением 2,5 объема холодиого спирта и оставляют ва ночь для формирования осадка, РНК отделяют центрифугированием 10 мин ; при 4000 об/мин, промьгаают несколько раз холодным спиртом, осадок РНК р астворяют в воде., содержащей 10%-ный HaCt и оставляют на несколько часов дляформирования осадка. Выпавший осадок РНК выделяют центрифугированием 10 мин ,при 4000 об мин. К надосадочной жидкости снова добавляют 3 объема холодЯ9ГО спирта. Осадок тРНК собирают центрифугированием, как указано выше тРНК растворяют в холодной воде и добавляют 1%-ный МаОН до рН 10,0 и ийкубируют при 1 ч для освобождения тРНК от аминокислот. Раствор тРНК нейтрализуют 1 М CHjCOOH на холода и очищаиот на колонке с сефадек-

сом (г-100}.

I Аминоацил-тРНК-синтетазы получают гомогенизированием семян хлопчатника в 0,025 М-грис -ней , буфере рН 7,5, содержсицем 0,01 М 10%-ный глицерин,. 0,01 М маркап|4рэтанола (на 100 г семян добавляли 200 мл буфера) и центрифугируют 20 мин при 20000 об/мин. Надосадочную жидкость снова центрифугируют 60 мин при 40000 об/мин.Г- К надосадочной жидкости добавляют сухой сульфат, аммония до 17%-ного насыщения. Осадок отделяют центрифугированием 20 мин при 15000 об/мин. Л надосадочной жидкости медленно в течение 2ч добавляют сухой сульфат , аммония до 37%-ного насыщения и оставляют на 2-4 ч для формирования осадка. Осадок отделяют центрифугированием 20 мин при 1500 об/миЕ. растворяют в вышеуказанном буфере и освобождают от примесей путем диализа на ночь. Фермент концентрируют с по|моиью сефадекся Г-200.

Реакцию аминоацилирования проводят следующим образом. 0,5 мл тРНК (0,2 мг) инкубируют с 0,1 мл аминоацил-тРНК-синтетазой (0,1 мг) в присутствии С-серина в среде, содерИсточник выделения

Удельная активность тРНК, имп/мин мг РНК

жащей 100 мкМ трис -нее буфере pft 7. 3,15 мкМ К-соли АТФ, 20 мкМ 2 мкМ 2-меркатоэтанола. Конечный объем 1 мл.

Инкубацию проводят 10 мин при . Реакцию останавливают добавлением 0,1 мл 20%-ной.;триХлоруксусной Кислоты и осаждгиот тремя объемами спирта. Осгшок отделяют центрифугированием ,10 мин при 3000 об/мин.

Осадок промывают 70%-ным холодным спиртом 10 раЗэ растворяют 10%-ным раствором NaCt и пропускают через колонки с сефадексом Г-100 (размер колонки 300 ММХ12 мм). Радиоактивность проб просчитывают на диаксановом сциитиляторе-счетчике МАРК-2. Процент заменяемости фермента определяют по степени аминоацилирования тРНК устойчивогосорта Ташкент 1 ферментом 108 Ф и С 4727, т.е. по уровню включения -серина в акцепторную часть тРНК этими ферментами. Данные, приведенные в таблице показывают , что фермент из восприимчивых сортов (108 Ф и С 4727) имеет процент заменяемости от 30 да 50%, а фермент из устойчивого сорта Ташкент 1 - 80-90%, т.е. фермент из невосприимчивого сорта, почти полностью ацилирует тРНК восприимчивых |СОртов. Таким образом, фермент неустойчивых сортов не способен полностью Гацилировать тРНК устойчивого сорта Ташкент 1, что указывает на репессивность генома семян, ответственого за кодирование определенных изоорм аминоацил тРНК синтетазы специичные к серину.

В таблице представлена активность миноацил-тРВК-синтетаз в реакции миноа1дилирования серил-тРНК.

Предлагаемый способ позволяет лочно и быстро определить устойчивость хлопчатника к вилту в лабораторных условиях на уровне семян.

Заменяемость фермента, %

Аминоаиил-тРНК

т РНК Синтетаз

Сорт

1

Ташкент-1 108-Ф С-4727

100 100

100 Формула изобретения Способ определения устойчивости хлопчатника к вилту, включающий тестирование семян на возбудителе дан- 25 ного заболевания, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса определения и повышения его точности, проводят реакцию аминоацилирования тРНК-ферментом 30 :аминоацил-тРНК-синтетазы, выделенной из разных по устойчивости сортов.

Продолжение таблицы и по заменяемости ферментов определяют степень устойчивости к заболеванию. . Источники информсщии, принятые во внимание при экспертизе 1.Информационные фоны в фитопа тологии. Научные труды ВАСХНИЛ, М., Колос, 1979, с. 104-105. 2.Авторское свидетельство СССР №511917, кл, А 01 Н 1/02,. 1974 (прототип).