Способ получения лизил-тРНК-синтетазы Советский патент 1987 года по МПК C12N9/00 

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способам получения ферментов - аминоацил-тРНКсинтетаз, которые могут найти применение в молекулярной и физико-химической биологии при изучении процессов биосинтеза белка в тканях животных. Целью изобретения является повыше ние выхода фермента и упрощение способа. Способ осуществляют следующим образом. Проводят гомогенизацию животного сырья(мьшечной ткани кролика, цент рифугирование, диализ, хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе с элюцией растворо КС I в буфере. Мьшечную ткань кролика при гомогенизации обрабатывают 4-5 м АТФ, растворенной в фосфатном буфере (буфер А), содержащем 10 мМ КН2Р04, 25 мМ KCI, 5 мМ (CH3COO)2Mg, 1 мМ дитиотреитола, 1,0 М глицерина, рН 6,9-7,1. Надосадочную жидкость диализируют против указанного буфера, а при хроматографии колонку промьюают последовательно 0,02 М и 0,05- 0,07 М раствором КС1 в 0,025 М трис-НС 1 буфере рН 7,4-7,6 (буфер Б), содержаще 10 мМ MgCl-j, 0,1 мМ дитиотреитола, 2,0 М глицерина, и элюируют целевой продукт 0,09-0,1 М раствором КС1 в указанном трис-НС 1 буфере. На фиг. 1 представлена хроматограмма надосадочной (пострибосомальной) жидкости на ДЕАЕ целлюлозе, где I - оптическая плотность (при длине волны 280 нм), которая отражает коли чественный выход лизил-тРНК-синтетаsbij 2 - удельная активность целевого фермента. На фиг, 2 представлена электрофореграмма фермента лизил-тРНК-синтетазы в полиакриламидном геле в при сутствии 0,1% додецилсульфата натрия .Пример 1. 200 г измельченны мышц кролика гомогенизируют с 400 мл буфера А, в который добавляют 4 мМ АТР. Гомогенат процеживают через ткань и центрифугируют 20 мин при 12 000 g. Надосадочную жидкость подвергают центрифугированию (центрифуга VAK) при 140 000 g в течение 60 мин. Полученную прозрачную пострибосомальную фракцию диализируют в течение 18 ч против 2 л буфера А, Ди лиз проводят в целлофановых мешочках на магнитной мешалке. Раствор после диализа в объеме 210 мл, содержащий 6,1 г белка с активностью по С-лизину 3,6 пмоль, наносят на колонку размером 35-4 см, заполненную ДЕАЕцеллюлозой (отечественного производства), которую уравновешивают буфе- ,, ром Б, рН 7,4. Колонку последовательно промывают 0,02 М КС 1, растворенным в буфере Б (1450 мл) со скоростью 40 мл/ч, затем 0,05 М КС 1 в том же буфере (1500 мл) со скоростью 50 мл/ч. Затем осзтцествляют элюцию целевого фермента с помощью 0,1 М КС I в буфере Б, в результате чего получают фракцию в объеме 80 мл, содержащую 10 мг белка с активностью по С-лизину 1092 пмоль. Выход целевого фермента лизил-тРНК-синтетазы составляет 49% со степенью очистки 303 раза. Пример 2. 200 г измельченных мышц кролика гомогенизируют с 400 мл буфера А, рН 7,0, содержащего 4 мМ АТР. Получение пострибосомальной (надосадочной) фракции и ее диализ осуществляют, как в примере 1, Диализат в объеме 200 мл с содержанием 6,4 г белка и удельной активностью по С-лизину 4,6 пмоль наносят на колонку размером 4-25 см, заполненную микрогранулированной Ватман ДЭ-32 ДЕАЕ-целлюлозой (Англия), уравновешенную буфером Б, рН 7,5. Колонку промьюают 1200 мл 0,02 М КС I в буфере Б со скоростью 40 мл/ч до контрольной экстинкции ( нм) 0,1, затем 0, КС в вьшеуказанном буфере, объем 1350 мл, со скоростью 50 мл/ч, после чего прово элюирование целевого фермента буфером Б, содержащим 0,1 М КС I, получают фракцию в объеме 100 мп, содержащую 15 мг белка с удельной активностью по С-лизину 139б пмоль. Выход фермента 67%, очистка 300 раз. Пример 3. 200 г измельченных мьш1Ц кролика гомогенизируют с 400 мл буфера А, рН 7,1, содержащего 5 мМ АТФ. Получение надосадочной.пострибосомальной жидкости и диализ осуществляют, как в примере 1, 200 мл диализата, содержащего 4,4 мг белка с удельной активностью по С-лизину 4,6 пмоль, наносят на колонку размером 4-20 см, заполненную ДЕАЕ-целлюлозой фирмы Реанал (Венгрия), уравновешенную буфером Б, рН 7,6, Колонку промьтают 1200 мл 0,02 М КС I в буфере Б со скоростью 40 мл/ч, затем 1350 мл 0,07 М КС I в вьшеуказанном буфере. Элюирование целевого фермента осуществляют 0,09 М КС1 в буфере Б, получают фракцию в объеме 80 мл, содержащую 9 мг белка с удельной активностью 1280 пмоль. Выход 56%, степень очистки 280 раз. Выбор заявленных в формуле режимов поясняется при сопоставлении выхода и гомогенности целевого фермента в зависимости от концентрации раствора АТР (граничные и .запредельные значения) при гомогенизации в табл.Ц от концентрации раствора KCI (граничные и запредельные значения) при последовательной промывке и элюции - в табл. 2. Для проверки чистоты фермента, получаемого согласно заявляемому споссбу, были использованы электрофоретический и ферментативный методы. Результаты проведенного электрофореза целевого фермента, полученног в примерах 1-3, в полиакриламидном геле в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия показали, что очищенный фермент гомогенен, о чем свидетельствует злектрофореграмма при разных концентрациях фермента (электрофореграмма фиг. 2). 1

Таблица 1 494 Во всех препаратах целевого фермента отсутствует активность метионил-тРНК-синтетазы, с которой наиболее вероятно образование комплекса в мьшечной ткани. Инкубация фермента с избытком немеченого лизина и мече- . ным белковым гидролизатом хлореллы не привела к включению метки, что свидетельствуетоб отсутствии других аминоацил-тРНК-синтетаз в полученном целевом продукте. При использовании предлагаемого способа достигается положительный эффект который по сравнению с известными методами выражается в повышении выхода конечного продукта; 50-67% целевого фермента в отличие от 5-15% по способу-прототипу; в упрощении способа за счет уменьшения количества операций хроматографии вдвое и сокращения времени, в частности в заявляемом способе проводят 4 операции за 63-67 ч в сравнении со способом-прототипом - 10 операций за 118-128 ч или со способом-аналогом 14 операций за 150-180 ч; в расширении источников сырья - фермент лизил-тРНК-синтетаза впервые выделен из мышечной ткани кроликов, в получении высокоочищенного препарата со степенью очистки в 300 раз.

1.СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ЛИЗИЛтРНК-СИНТЕТАЗЫ из сырья животного происхождения, включающий гомогенизацию ткани, центрифугирование, диализ, хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе с элюцией фермента раствором КС I в буфере, о тличающийся тем, что, с целью повышения выхода фермента и упрощения способа, в качестве исходного сьфья используют мьшечную ткань кролика, которую при гомогенизации обрабатывают 4-5 мМ раствором аденозин-3-фосфорной кислоты в фосфатном буфере рН 6,9-7,1, надосадочнуга жидкость диализируют против фосфатного буфера, а при хроматографии колонку промьшают последовательно 0,02 М и 0,05-0,07 М раствором КС I в 0,025 М трис-НС1 буфере, рН 7,47,6, и затем элюируют целевой про(Л 1укт 0,09-0,1 М раствором КС1 в указанном трис-НС| буфере. 2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют фосфатный буфер, содержащий 10 мМ KHJPO, 25 мМ КС, 5 мМ (CH-jCOO) Mg, 1,0 tM дитиотреитола, 1,0 М глицерина. со ел 3.Способ, поп, 1,отличаю05 щ и и с я тем, что используют трис со НСI буфер, содержащий 10 мМ MgCl, 0,1 мМ дитиотреитола, 2,0 М глицерина.

повышение выхода и качество очистки при одновременномперерасходе АТР

Таблица 2