Способ получения оксипроизводных индолил-3-уксусной кислоты Советский патент 1983 года по МПК C12P1/02 C12P13/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКСИПРОИЗВОДНЫХ ИНДОЛИЛ З-УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ Изобретение относится к микробиопо- гической промышленности, а именно к спо собу получения оксипроизводных инцолил-3-уксусиой кислоты (ИУК), 5-Оксииндолил-З-уксусную кислоту {5НЭН-ИУК) используют в медицине в качестве тест-препарата для диагностики нарушений метаболизма серотонина при различных заболеваниях центральной нер& ной системы. Кроме того, 5-ОН-ИУК и 4-сжсиивдолил-З-уксусная кислота (4-ОН -ИУК) могут быть использованы в качестве полупродуктов Для синтеза биол(гически активнь1х соединений, таких как серотонин, буфотенин, Мексамин, псилошш и др. Известен способ получения оксипроиз- водных ИУК путем микробиологичеокой трансформации. В качестве трансформирующей культуры используют грибы Asperq KEuS nitjjer . Используемые штаммы позволяют проводить трансформацию только с низкой исходной концентрацией ИУК 1 Недостатками данного способа являются НИЗКИЙ оксипроюводвых (25%) и длительность процесса траасформаайв (48ч).. Известен также способ окси« производных индолил-З-уксуснойкиспоГы, предусматривающий аэробное вырашвванве т инсформируютаей культуры AspercjiCe /s nicker ИБФМ F-212 на питательной среде, содержащей глюкозу в кагчестве источника углерода, и минеральные coim, отделение мицелия с последующим его использованием для микробнологнческой трансформации иидолил-З-уксусной киспоты. Выращивание ведут- , что соответствует середине логари||мшеской фазы роста гриба. Полученный Kfвцелий может быть использован для трансформации один раз, после чего пшроксил рующая активность культуры резко свн жается. В результате Трансформации, которая проходит за 18-24 ч, образуется 6О% 5-окси-ИУК и 40% 4-сжси-ИУК 2 Недостатком этого способа является невысокий выход оксипроизводных ИУК Q на единицу биомассы трансформирующей культуры, что связано с однократностью использования для трансформации мицелия I Asperc iCEus nicjer ИБФМ F-212. Цель изобретения - увеличение выхода , конечных продуктов, на единицу биомассы трансформирующей культуры. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения оксипроизвод Hbix индоли;ь-3-уксусной кислоты, предусматривающему аэробное нырйщивание культуры flepercglEEus niofer ИБФМ П-21 на питательной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода и М№ нёральные соли, отделение мицелия с последующим его использованием для микро биологической трансформации индолил-3-уксусной кислоты, предложено выращивание культуры вести до конца первой трети логари(}мической фазы роста крть- туры, при этом в питательную .среду вводить 2-4% белково-витаминного концентрата, а мицелий использовать для микробиологической трансформации многократно. Способ осуществляют следующим образом. Культуру / spErt iEEus ИБФМ F-212 выращивают на синтетической среде, содержащей белково-витаминный ковн центрат, до конца первой трети логарифмической фазы роста культуры; после отделения мицелия от культуральной жидкости и отмывания его стерильной водой ресуспевдируют .в буферном растворе, добавляют раствор ИУК в этаноле. Гидроксипирование проходит полностью за 8-12ч, количество 5-окси-ИУК в реакционной среде составляет 5О-6О%, 4-окси-ИУК 40-50% от исходного количества ИУК. Затем мицелий отмывают и стадию гидрокс1ширования повторяют многократно, добавляя для каждой трансфор мации раствор ИУК в этаноле. Пример. Культуру AsperciriCKus nicrer ИБФМ F-212 поддерживают на скошенном сусло-агаре. Колбы засевают суспензией спор, полученной смывом спор со скощенного сусло-агара стерильной водопроводной водой. Культуру выращивают в колбах емкостью 750 мл с 150мл среды следующего состава, г/л: глюкоза 15,0; БВК 3,0; Fe 5О4-7Н2О О,ОО5;. КСе О,5; 0,5; К2НРО4 1,0; (NH4)2HPO4 1,0; СаСО 3 3,0 на качалке 220 об/мин, при 28°С в течение 24ч. Полученной культурой в объеме 10% засевают инокулятор емкостью ЗО л с 20 л питательной среды того же состава и выSSращивают инокупят в течение 24 ч при леремещивании ЗОО об/мин, расходе воз духа 0,6 об/1 об, температуре . Выросшей культурой в объеме 20% засевают ферментер объемом 100 л, 7О л питательной среды того же состава. Выращивание трансформирующей культуры проводят при , при перемешивании 500 об/мин (pOg - 75%). Через 12ч роста мицелий отделяют от среды, промывают стерильной водопроводной водой и ресуспендируют в 70 л стерильного 1/15 М фосфатного буфера рН 5,5 (из расчета 30 г влажного мицелия на 1 - л буфера). Для трансформации вносят раотвор ИУК в этаноле (35г в 250мл этанола) из расчета 0,5 г/л. Процесс гфоводят при 28°С и перемешивании 500 об/мин. Гидроксилирование полностью проходит за 1Оч, по окончании трансформации количество 5-ОН-ИУК составляет 57%; 4-ОН-ИУК 43% от исходного количества ИУК. Мимелнй после трансформации отмывают стерильной водой и вновь используют для трансформации индолигь-3-уксусной кислоты (из расчета О,5 г/л). Гидроксилирование полностью проходит за 12ч, количество 5-ОН-ИУК составляет 5О% и 4-ОН-ИУК 5О%. Мицелий после проведения второй трансформации отмывают стерильной водой и Испол1:дуют для проведе шя третьей трансформации. Количество 5-ОН-ИУК 56% и 4-ОН-ИУК 44% через 15ч трансформации. . После четвертого использования гидроксилирующая активность значительно падает и составляет 20% от первоначальной. . Контроль за ход см трансформации осуществляют методом тонкослойной хроматографии на пластинах S- 6ufo€ UV254 хроматографическую пластинку наносят . полосой культуральную жидкость (из расче,та 2О мкг вещества). Разделение продуктов трансформации проводят в системе; изопропанол-бензол кони. УНз (4:1:: :1 об/об). Хроматограммы просматривают в УФ свете. Для количественного определения используют спектрофотомет- рический метод. Оптическая плотность элюированных этанолом продуктов при Лтат 278 ммк (5-ОН-ИУК) и 269 (4-ОН-ИУК). Количество ИУК и оксипроизводных определяют по заранее построенным калибровочным кривым. Таким образом, описанный способ по с1иввеншо с известным позволяет увеличить выход оксипро из водных ИУК на единицу биомассы трансформирующей куль-

туры, так как делает возможным многократное нспользованне мнцепия. При этом также в два {юза сокращается время трансформации.

Формула изобретения

Способ получения оксипроизводных и дояв№-3-уксусной кислоты, предусматр ваюшиб аэробное вырвЩ11ваш е культуры ЛерегфйВиб niqrer ИБФМ F-212 на п тательной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода и минеральнь1е соли, отделение мйцелия с последующим его использовавием для мик- робиологкческой трансформации индолил-3-уксусной кислоты, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода конечных продуктов на единицу биомассы трансформирующей культуры, выращивание культуры ведут до конца

первой трети логарифмической фазы роста культуры, при этом в питательную среду вводят белково-ввтамЕВВого ковцентрата, а мипелий нспопьзуют дпа мвк робиологическрй тра сформаонв многократно,

Источники внформашга, . . принятые во вннманве при экспертвзе

1.Дворникова Т.П., Суворов Н.Н., Скрябин Г. К. Гидроокевлированве в пятое положе ю 8вдопВ№ 3-уксусноЙ киспоты, погружевВов культурой Asperq;i€Cw5 Микробиология, т. 37, № 1, с. 44, 1968.

2.КшаевЕВсо К.А. Баклашова J.F., Козловский А.Г., Лрвнбасаров М.У., Скрябин Г. К. О гидроксштровашга ввйр. лил-З-уксусвов кислоты грвбом perwiJlu niogerИБЧМ F-12. - Прикладная биохимий и мюфобяологая, т. 13, вып. 2, с. 248-254, 1977.