Штамм бактерий РнотовастеRIUм рноSрноRеUм - продуцент L - аргининдекарбоксилазы Советский патент 1991 года по МПК C12N9/88 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм бактерий, продуцирующий инду- цибельную L-арнининдекарбоксилазу (Apr Д/К).

Цель изобретения - выявление более активного штамма Photobacterium phosphorium - продуцента индуцибель- ной L-аргининдекарбоксилазы.

Штамм является строгим галофилом (не растет без NaCl), для получения ферментного экстракта клетки разрушают осмотическим шоком.

Штамм Photobacterium phosphoreum 189 выделен из морской воды в Филип-,

пинском море в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО АН СССР г; Красноярска. Штямм хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под номером ВКМ В- 1716Д.

Морфологические признаки. Короткие палочки размером 0,8-1,,8-2,4 мкм. Граммотрицательны, капсул не образуют. Подвижны благодаря одному или пучку -(1-3) неочехленных полярных жгу тиков. Культуралъные свойства. Рост бактерий Photobacterium phosphoreum 189 на различных агаризованных средах

00 00 САЭ Ј

3167

при 30°С после 24 ч культивирования I представлен в табл. 1.

На. всех агаризованных питательных средах колонии круглые, желтовато-ко- ричневые, прозрачные, блестящие с правильными краями.

Физиологические свойства. Штамм является факультативным анаэробом Оптимальная температура для роста и свечения 20-30°С„ Растут при и не растут при 35°С. Растут при рН среды 6,0-9,0. Восстанавливает нитраты до нитритов. Индол и сероводород не выделяют. Не выделяют амилазу, липазу, желатиназу,Растет на синтетической среде, содержащей в основе морскую воду, глюкозу и NHfl-Cl.

Усваивает глюкозу, маннозу, фрук- тозу, мальтозу, галактозу, глицерин. Усваивает пептон, дрожжевой экстракт, а также соли аммония. Хемоорганотроф, Для роста и люминесценции необходимо присутствие в среде ионов натрия. Оп- тимальная концентрация хлористого натрия 2,5-3,0%. Обладает люминесценцией в сине-зеленой области спектра.

Признаки штамма устойчивы.

Музейная культура хранится в про-, бирках на полужидкой агаризованной среде Егоровой под вазелиновым маслом. Она хорошо сохраняется в течение 1 г,, а при длительном хранении следует пересевать,

.Пример 1. Для оживления музейной культуры Photobacterium phosphor eum 189 бактерии пересевают на питательный агар (ПА) с 3% NaCl в чашки Петри и инкубируют 24 ч- в термостате при 30°С. Оживленную культуру пересевают в пробирки на косяки ПА с 3% NaCl и инкубируют 24 ч при .

Для получения икокулята применяют среду № 1. Данную среду разливают по 100 мл в конические колбы емкостью 250 мл. Среду стерилизуют 30 мин при 0,5 атм.. Простерилизованную среду засевают суспензией клеток в количестве 5 мл (по объему). Культуру выращивают 12 ч при 30°С при слабой аэрации (100 об./мин).

Для получения биомассы Ph.phospho- feum 189 штамм выращивают на традиционной полусинтетической для данного вида среде (№ 1, дополнительно добавляя L-аргинин КС1, как индуктор), г/л NaCl 30,01, MgS04-7H,2p,0,2; КНвРОц 1,0; . 6,0; (NH puHP04 0,5; гли

0 5

0 5

Q I

,-с

0

5

0

церин 3 мл, пептон 10,0, L-аргинин HCJ. 1,5}- дистиллированная вода до 1 л;1 рН 6,4±0,05.

Питательную среду разливают по 200 мл в качалочные колбы емкостью 500 мл и стерилизуют 30 мин при 0,5 атм. Стерильную питательную сре- .ду засевают инокулятом - культурой Ph.phosphoreum 189 в количестве 10% (по объему). Выращивание продуцента в колбах проводят, на качалке (100 об./мин) согласно известным условиям (начальной рН среды 6,4, температура культивирования 30°С, продолжительность роста 12ч).

Биомассу бактерий отделяют центрифугированием на центрифуге ЦЛС-3 при 4000 об./мин в течение 10 мин. Биомассу промывают 3%-ным NaCl и для экстракции фермента заливают 20 мл 0,2 М ацетатного буфера с рН 5,2, охлажденного до 4СС, с добавлением 5-10

-S-,

М пиридоксальфосфата и М ЕДТА. В экстракте определяли L-арги- ниндекарбоксилазную активность манометрическим методом в аппарате Вар- бурга.

За единицу Apr Д/К активности принимали такое количество фермента, который при температуре 37°С и рН реакционной смеси 5,2 через 1 мин от субстрата (0,025 М L-api инина НС1) отщепляют 1 мкмоль С02. Apr Д/К- активность выражали единицами в пересчете на 1 мг сухих клеток и в мг белка (специфическая активность). Белок оп1- ределяли методом Бредфорда.

Пример 2. Для получения биомассы культуру Ph. phosphor eum 189 выращивают на традиционной среде № 2 данного вида, дополнительно добавляя как индуктор L-аргинин НС1, г/л: NaCl

зо,о; 1,о; (NH Hpd/f. 0,5;

MgSOfl- THgO 0,1; глицерин 3 мл пеп- тон 10,0, дрожжевой экстракт 0,5Ј L-аргинин НС1 1,5J дистиллированная вода до 1 л рН 6,410,05.

Способ приготовления среды, условия культивирования продуцента, определение активности как и в примере 1.

Пример 3. Для получения биомассы культуры Ph.phosphoreum 189 выращивают на традиционной среде данного рода следующего состава, дополнительно добавляя как индуктор L-аргинин НС1, г/л: пептон 10,0, NaCl 30,01, MgS04-7HeO 0,55 КНеР04 1,0, L-аргинин

НС1 1,51 рыбная вытяжка 0,5 л, водопроводная вода до 1 л рН 6,410,05.

Способ приготовления питательной среды, условия культивирования продуцента, определение активности как и в примере 1..

Предлагаемая культура на известной среде не росла, так как- в ней отсут- ствует нужное количество NaCl. При добавлении в известную среду 3% хлористого натрия культура росла; но выход биомассы и Ь-аргининдекарбок- силазная активность ниже и составля

ет 2,56 ед./мг сухих клеток и 14,5 ед./мг белка.

В табл. 2 приведены данные об I,- аргининдекарбоксилазной активности штамма Photobacterium i phosphoreum 189 и известного Escherichia coli В. Как видно из табл. 2, предлагаемый штамм Photobacterium phosphoreum 189 отличается от известного в 1,65Штамм бактерий Photoba phosphoreum BKMB-1716D -

2,68 раза большей активнрсть в 1 мг, 25 L-аргининдекарбоксилазы.

.5

,

78834Ь

сухих клеток. Кроме того, выход биомассы на 37% выше по сравнению с известным при тех же условиях культиви- рования, а специфическая активность в два и больше раза выше.

Данное преимущество может существенно уменьшить себестоимость ферментного препарата при его изготовлении. Ферментный препарат L-аргининде- карбоксилаза может быть использован при определении L-аргинина и при получении агматина из Ь -аргинина путем его декарбоксилирования. Для получения определенного количества ферментного препарата уменьшается число ферментации, что делает штамм выгодным для применения в промышленных условиях.

10

15

Формула изобретения

Штамм бактерий Photobacterium phosphoreum BKMB-1716D - продуцент

L-аргининдекарбоксилазы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению нового штамма, обладающего высокой L- аргининдекарбоксилазной активностью. Цель изобретения - выявление более активного штамма Photobacterium phosphoreum - продуцента индуцибельной L-аргининдекарбоксилазы. Штамм Ph. phosphoreun (189) BK1IB-1716D был выделен из морской воды в Филиппинском море и было выявлено новое семейство - высокая активность L-аогининдекарбок- силазы (3,23-5,23 ед./мг сухой бактериальной массы и 25,33-29s60 ед./мг белка). Штамм сохраняет активность при хранении его под вазелиновым маслом и в лиофилизировааном состоянии. 2 табл. §

Агаризованная среда

Егоровой (пример 3) 1,0-1,2

Питательный агар сухой

(гидролизат кильки) +

+ 37, NaCl1,8-2,0

Агаризованная полусинтетическая Среда (пример 1)UO-1,2

Агаризованный мясо-пептонный бульон + 3% NaCl 0,5-0,7

Escherichia coli В,

Таблица 1

Среда

Диаметр колонии, мм

Таблица 2

0,40

0,150

1,95

13,00

Photobacterium phospho- reum 189 (BKM B-1716D)

1 2 3 .

Составитель И.Привалова Редактор Н„Яцола Техред С.Мигунова Корректор М.Самборская

Заказ 4681

Тираж

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

гПродолжение таблицы

0,109 3,23 29960 0,136 3,44 25,33 0,182 5,23 28,75

Подписное