Способ получения оксипроизводных индолил-3-уксусной кислоты Советский патент 1983 года по МПК C12P17/10 C12P7/42 C12R1/685 C12N11/04 

о со

О) Изобретение относится к меаицияской и химико- рмацевтической промышлен- ности и касается микробиологического способа гиароксилирования индольного соединения - инаоли;& -уксусной кислоты (ИУК). Ферменты, осуществляющие такой процесс гицроксилаэы можно отнести к группе малоизученных ферментов, для функцисжирования необходимы различные кофакторы. В то же время известно, что иммобилизованные клетки можно рассматривать как полифериентяую систему, способную к регенерации кофакторов и, вследствие этого, имеющую высокую стабильность. Кроме того, в ряде случаев иммобилизованные клетки име ют более высокую ферментативную активность как по сравнению со свободными клетками, так и по сравнению С иммобил зованными ферментами. Известен способ гидроксилирования ве щества S Рнхштейна в П р-положении иммобилизованнс в полиакриламидном геле культурой Cur-vutoria Cunala. Вре мя трансформации 15 ч, иммобилизованная культура используется однократно (в периоди 1еском процессе), посла чего наблюдается снижение активности El3 . Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ получения оксипроизводных индолил-3уксусной кислоты путем гидрокснлированияиндолил-3-уксусной кислоты (ИУК) с-помсяцью мицелия культу{и 1/ реу-д-4Вео WOfer ИБФМ-f . При этом количеств во составляет А-60%, 4-ОНИУК- 4О%. При осуществлении этого способа куль туру для трансформации обычро выращива ют на синтетической среде в течение 1824 ч до середины логарифмической фазы роста, затем мицелий многократно отмывают стерильной водопроводнсА водой и используют для проведения процесса гидроксилирования с исходной концентрацией ИУК 0,5 г/л taj . Недостаток этого способа - однократность использования мицелия, т.е. для проведения каждой трансформации необходимо заново выращивать культуру, процесс невозможно вести в непрерьшном режиме. Кроме того, недостаточно высок съем продукта с единицы биомассы культуры соответственно 0,3 и 0,2 мг/мг биомассы). Целью изобретения ЯЬляется интенсиЬикация процесса гидроксилирования индопип-3-уксусной кислоты, под которой подразумевают обеспечение возможности многократного использования культуры, увеличение времени работы культуры при сохранений вьюокой гидроксилирующей активности, повьпиение выхода продукта на единицу мицелия, обеспечение возможности перевода процесса в непрерывный режим Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения оксипроизводных индолил-З-уксусной кислоты путем гидроксилирования индолил-З-уксусной кислоты с помсяцью мицелия культуры AsperglEEus viigfet- ИБФМ- -212, используют мицелий указанной культуры, иммобилизованный в полиакриламидном геле. С целью стабилизации гидроксилазной активности мицелия в процессе использования, его инкубируют в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральньв соли, затем проводят трансформацию на голодной среде, в воде или буферном растворе. Пример. Культуру ) trigs 1 ИБФМ-Р-212 выращивают на синтетической среде следующего состава, г/л: (МИ4)гНР04 2,0} 1,0;М 5О47 HiO О,5; КСе О,5; FfeSO -Т, Н О 0,01; СоСО, 3,0; глюкоза 20,0; белково-вита- минный концентрат 3,0; вода дистиллированная до 1,О л. Через 18-24 ч роста мицелрй отмывают от среды трсйным объемом стерильной водопроводной воды. Отмытый мицелий используют для полимеризации: берут 1,5 г влажного мицелия (вес сухого, мицелия ЗОО мг) в 6 мл фосфатного буферяого раствора (рН 5,5), прибавляют 11 мл раствора мономеров (1,9 г акрипамида и О,1 г метиленбисакриламида в 11 мл воды), 4 капли К1,Ы,Н,ы -тетраметилэтилендиамина, разведенного водой (1:1) и 3 мл О,5%-«ого раствора персульфата аммония. Полимеризацию проводят при . Образовавщийся гель протирают через сито с размером пер 1000-.2000 мкм. Полученные гранулы отмывают декантацией стерильйой водопроводной водой (8-10 раз) и дважды по 60О мл фосфатным буферным раствором (рН 5,5). Отмытые гранулы суспендируют в 1ОО мл фосфатного буферного раствора, помещают в две конические колбы Зрпенмёйера объемом 250 мл с 5О мл буферного раствора в каждой. В колбы вносят.по 1 мл этанольного раствора ИУК, содержащего 25 мл ИУК. Трансформацию проводят при 28С на качалке 22О об/мин. Гицроксилирование полностью проходит за 24-ЗО ч с образо вемтм 55-6О% 5-ОН-ИУК и 45-40% 420Н-ИУК. Кснтр м1Ь за ходом трансформации осуществляют метопом качественной и количественной тонкослойной хроматографии на пластинках S-i6o oE . На хроматографическую пластинку наносят полосой культуральную жидность (из расчета 2О мкг вещества), разделение продуктов трансформации проводят в системе изопропаноп - бензол- KC meHTw рированная ММ- (4:1:1 ). Хроматограммы просматривают в УФ-свете на . ультрахемископе. Для количественного определения продуктов трансформации используют спектрофртометрический метод. Оптическую плотность элюированнык этанолом продуктов определяют ммк (З-ОН-ИУК) и 269 ммк (4-ОН-ИУК). Количество ЯУК и ее оксипроизводных определяют по заранее построенным калибровочным кривым. П р и м е р 2 , Выращивание кульlypbi и иммобилизацию мицелия проводят по примеру 1. Далее отмытые гранулы суспендируют в 1ОО мл стерильного /Б сусла в мецишшсксЛ копбе объемом 750 мл в помещают на качалку 22О об/мин при 2&°С. Через 2О-24 ч инкубации в питательной среде гранулы многократно отмывают сначала стерильной водопровод ной ьодой, а после этого стерилыным фосфатным буферным раствором ( 5,5 :3атем проводят трансформацию по примеру 1. Гидроксилирование полностью прохоаит за 15-18 ч с образованием 4-ОН-ИУК и 55-60% ИУК, При увеличении концентрации ИУК до 1 мг/мл Гидроксилирование прохоаит за 24 ч. После проведения трансфер мадии, гранулы, отделенные от реакционной среды, промывают 5 раз по 2ОО мл стерил1ж водопроводной водой, 2 раза по 1ОО мл буферным раствором (рН 5,5 и используют для следукидей трансфо{ мации. Гранулы с иммобилизованным мицелием используют многократно. При сни женин гидрокснлирующей активности проводят повторное инкубирование гранул в питательной среде и затем новую серию последовательных трансформаций. Эту операцию повторяют до необратимого сни жения гидроксилирукяцей активности. Возможно 18-24-разовое использование гранул с мицелием при трехразовой пери цической инкубации их в питательной реде. Пример 3 . Выращивание кульуры, .иммобилизацию и инкубирование ранул в питательной среде проводят по римерам 1 и 2. Гранулы после инкубаии отмывают и помещают в стеклянную ермостатированную колонку (высота коонки 110 мм, диаметр ЗО мм) с возущным барботером, высота столба граул 5О,О мм. Снизу в колонку с n ioью перистальтического насоса подается раствор 1/15 М фосфатного буферар Н 5,5, содержащий 0,5 мг/мл ИУК. При уцельг ной скорости протока (М ) мг гранул - ч 0,1 ч и колонка работает в течение 15 дн без снижения активности, суммарное количество оксипроизводных в течение этого периода 60-70%. В таблице представлены результаты сравнения гидроксилирующей активности свободного и иммобилизованного в ПААГ мицелия Из таблицы видно, что при использовании свободного мицелия биомасса используется однократно, удельная активность составляет 1,25; при использовании иммобилизованного в ПААГ мицелия сокращается время трансформации и увеличивается удельная активность. Инкубация гранул с мицелием в питательной среде позволяет значительно увеличить время работы используемого для трансформации мицелия. В зависимости от условий опы- . та, биомасса участвует в периодической трансформации многократно, либо в непрерывных условиях. Удельная активность инкубированных гранул с иммобилизованным мицелием вьшде активности свободного мицелия в 1,6 раз. Количество образованного оксипроиэводного на единицу биомассы у свободного мицелия составляет О,3 мг/1 мг биомассы. При использовании иммобилизованных гранул, инкубированных в питательной среде, количество оксипроизвод- ного на единицу биомассы возрастает в зависимости от условий опыта в 8 или 24 раза и составляет соответственно 2,4 либо 7,2 мг/1 мг биомассы. Таким образом, предлагаемый способ дает возможность получать оксипроизводные не только в периодических, но и в непрерывном процессе. Переход от периодического процесса производства к непрерывному с использованием иммобилизованных клеток позвопяет в большей степени .автоматиэ ровать процесс.

Иммобвлизацяя культуры Aspetg eeus шОвг ИБФМ-Я« 12 в полиакриламианый гель.позволяет использовать иммо(кзованный мицелий цля проведения многократных-, периоаических трансформаций без снижения гицроксилнруюшей актйь нести, значительно увеличивается выхоц оксипроизвоаньк ИУК на еаиницу биомассы мицелия. Возможно 18-24-разовое использование гранул с мицелием, а также провецение непрерывного процесса гицроксилирования ИУК в колонк 1х.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКСИПРОИЗВОДНЫХ ИНДОЛИЛ-3-УКСУСНОЙ кислоты путем гидроксилирования ИНД опил-3-уксусной кислоты с помощью мицелия культуры Asperg-ieBus ИБФМ-Р-212, отличающийся тем, что, с целью интенсификации процесса, используют мицелий указанной культуры, иммобилизованный в полиакрил- амидном геле.

0.2

0,3

qs . 0.2

0.3О.2

2,4 4,8 7,2 7,2 4.8

1,25

24

1 1

1,50

20 15 2,00

120

82,00

242,00 36О

Непрерывно2,00 36О