Штамм @ @ @ -82-продуцент холестериноксидазы Советский патент 1984 года по МПК C12N15/00 C12N9/04 C12R1/56 

Изобретение относйтеся к микробиологическому синтезу ферментов и может быть применено для получения ходестериноксидазы. Известен продуцент холестериноксидазы Streptomyces lavendulae ВКМ-А-591, который при культивирова нии на среде, содержащей глюкозу, аспарагин, дрожжевой экстракт и холестерин в качестве индуктора, в аэробных условиях образует до 2 г/л биомассы с активностью 3045 ед/г 0 . Недостатком этого продуцента явл ется невысокая холестериноксидазная активность, а также то, что при культивировании, на жидких средах Str. .lavendulae ВКМ-А 591 .образуе пигменты меланоидного ипа, затрудняющие получение и очистку ф рмент ного препарата. Наиболее близкими к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту являютс продуценты холестериноксидазы Str. hygrpscopicus, а также Str. griseofuscus и Str. acidomycesicus. При культивировании на .среде сложного состава, содержащей дорогостоящие компоненты, такие как пептон, крахмал и.дрожжевой экстракт, в течение длительного срока(з-4 сут в клетка актиномицетов содержится 10.6,1 284,6 ед/г холестериноксидазы 2J . Недостатком цветных продуцентов является то, что выращивание проводят в течение длительного срока на многокомпонентной дорогостоящей среде. Целью изобретения является штамм продуцент холестериноксидазы, облад щий высокой активностью при выращивании на среде простого состава в течение 1-2 сут и не образующий ,пигментов при культивировании на применяемых средах. Полученный штамм Streptomyces 1avendulае НИМИ- А8- 2(коллекция института биохимии и физиологии микроорганизмов, коллекционный номе ВКМ А-840 Д), являющийся высокоактивным продуцентом холестеринокси дазы, обладает следующими признакам Культурально-морфологические признаки штамма. На ,агаризованной среде СР-1 Красильникова колонии 7-10-ти суточного возраста белого цвета, гладкие, плоские, с pqBHbWH краями, диаметром 8-10 мм, пигмента не образует. На среде Гаузе-1 колонии розоватолилового цвета(цвет лаванды), гладкие или складчатые, диаметром до 8 мм, субстратный мицелий пепельносерого цвета, пигемента не образует. На картофельном агаре рост в виде крупных (Ю мм)колонии белого или слегка розоватого цвета, воздушный мицелий хорошо развит, белого цвета, субстратный мицелий бурого цвета, пигмент не образует. На.МПА растет плохо, воздушный мицелий не обраэ ует, колонии светложелтого цвета, 5-7 мм в диаметре, пигмент не образует, На сусло-агаре колонии розоватолилового цвета с хорошо развитым воздушным мицелием, 8-10 мм в диаметре, субстратный мицелий темносерого цвета. Физиологические признаки. Желатину разжижает, молоко коагулирует и пептонизирует. Сероводород и индол не образует. Нитраты не восстанавливает,, В качестве источника углерода потребляет глюкозу, фруктозу, маннит и ксилозу. Не потребляет сахарозу, рамнозу и инозит. На ломтиках картофеля растет обильно в виде серого налета. Оптимальная температура роста 28-30°С. При 37°С рост слабый, при 45 С - не растет. Обладает антибиотической активностью против граммоположительных и граммотрицательных бактерий. Штамм выделен из популяции коллекционного штамма Streptomyces lavendulae К 4004. При культивировании на жвдкой питательной среде определенного состава образует холестериноксидазу, активность которой составляет 170,5380, 5 ед. на грамм сухой биомассы. Сравнение преимуществ предлагаемого штамма с известными продуцентами приведено в таблице. Пример 1. В качестве исходного посевного материала используют культуру, выращенную на скошенном агаре в течение 10 сут и хранящуюся в холодильнике при . Применяют среду следующего состава г/л: глюкоза 20,0; NH4NOj2,0; белково-витаминный концентрат 3,0; вода водопроводная с рН 7,2. Среду разливают в широкие пробирки по 7 мл и

i

колбы Эрл нмейерана 250 мл по 70 мл. Смывом со скошенного агара засевают среду в пробирках(0,2 мл на 7 мл ередьЛ. Выращивание проводят на качалке с 240 об/мин в течение 48 ч при Полученной жидкой культурой засевают среду в колбах(7 мл культуры на 70 мл среды). Выращивание проводят на качалке с 190 об/мин в . течение 22 ч при .

Биомассу отделяют на центрифуге при 5000 об/мин и промьшают 1/15 М фосфатным буфером. Холестериноксидазную активность определяют по рписанной методике. За единицу холестериноксидазной активности принимают количество микромоль холестенона, образующегося под действием холесте т риноксидазы из холестерина за 1 мин при 37°С.

Активность биомассы составляет 380,5 ед. на 1 г.

П р и м е р 2. Штамм Str.lavendulae ВКМ - А840 выращивают в ферменте ре емкостью 00 л. Объем среды 28 л. Состав среды г/л: глюкоза 28,0; ,0; ,0; белково-витамин ный концентрат 3,0, рН 6,9. Среду

5250.4

в ферментере засевают 48-ми часовой жидкой культурой, выращенной на среде того же состава в колбах на 3 л. Объем посевного материала ни 5 ферментер 2,0 л. Выращивание проводят 22 ч. Биомассу отделяют сепари- рованием, дважды .промывают дистиллированной водой. Получают 3,0 г/л биомассы с холестериноксидазной активностью 364,0 ед. на 1 г.

Холестериноксидаза, полученная из биомассы предлагаемого штамма, может найти применение как реагент для клинических анализов лри количественном определении холестерина, а также может представить интерес как средство для снижения уровня холестерина в крови. Высокая холестеринОксццазная активность продуцента и отсутствие пигмента в биомассе и культуральной жидкости позволяет значительно повысить выход фермента и упрощает процесс очистки ферментного препарата.„

На опытной установке ИНМИ АН СССР получены партии ферментного препара та холестерйноксидазы, которые -были очищены в 5-7 раз.

ШТАММ STREPTOMCES LAVENDULAE ИНМИ А 8-2 (Всесоюзная коллекция микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, коллекционный номер А - 840 Д) ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗЫ,