Способ получения стероида Советский патент 1982 года по МПК A61K38/22 C12P1/00 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается получения лекарственных стероидов. Известен способ получения стероида путем микробиологического гидроли за эфира стероида с последующим выде лением целевого продукта fll. Однако известный способ обеспечивает незначительный вьйсод целевого продукта (40%). Цель изобретения - повышение выхо да стероида. Цель достигается тем, что способ получения стероида осуществляют путе микробиологического гидролиза эфира стероида с последующим выделением це левого продукта, а гидролиз ведут с помощью штамма Arthrobacter cftreus ИБФМ В-51 Arthrobacter citreus ИБФМ В-185 Brevibacterium luteum В-134 Brevibacterium cltreum ИБСМ В-131 ил Corunebacterium insidlosum ИБФМ В-13 Микробиологическую трансформацию проводят любыми известным способом (растущей культурой или отмытыми клетками), стероид вносят в органическом растворителе или в микрокристаллическом состоянии. Пример 1. Культуру Arthrobacter citeum В-51 поддерживают на кукурузно-глюкозном агаре, %: глюкоза 1; кукурузный экстракт 1; агарагар 3; водопроводная вода до I л; рН 6,8-7,2. Для выращивания микроорганизма используют 750 мл колбы Эрленмейра, содержащие 150 мл среды аналогичного состава, но без агар-агара. Для засева с косяков делают смыв 7,5 мл стерильной водопроводной водой. В колбу со 150 мл среды вносят 5,0 мл бактериальной суспензии, содержащей 2,0 г/л клеток. Биомассу измеряют нефелометрически с последующим пересчетом на вес сухой биомассы. Культуру выращивают 24-26 ч на качалке l80 о б/мин при до содержания

биомассы 2-3 г/л, затем вносят стероид - 21-ацетат кортизона (300 мг) в этанольном растворе (Ю мл).

Конечная концентрация стероида составляет 2 г/л. Через 48 ч трансформации процесс заканчивается. Результаты хроматографического анализа культуральной жидкости показывают, что -. содержание гидролизованного стероида, кортизона, составляет 95%.

Аналогичным образом используют для гидролиза ацетата кортизона (2 г/л) растущие клетки следующих штаммов. Результаты анализов приведены в :табл.I, Таблица 1

Arthrobacter citreus B-t85 Brevibacterium citreum B-131 Brevibacterium luteum B-134 Corynebacterium insidiosum B-137 Пример 2. Культуру Arthrobacter citreus B-51 выращивают аналогично примеру I. После выращивания клетки отделяют центрифугированием при бОООс, 20 мин ресуспендируют в стерильной водопроводной воде до необходимой концентрации {8 г/л) и используют для трансфор мации . Трансформацию осуществляют в условиях, аналогичных вырапяванию, в 750 мл колбах Эрленмейра, содержащих 150 мл реакционной смеси. Микрокристаллический стероид - 2 -ацетат кортизона (величина частиц 5-30//) вносят до конечной концентрации 100 г/л. Через 10-12 сут трансформации заканчи вается, культуральную жидкость отфильтровывают на воронке со стеклянным пористым дном (фильтр № 1) с одни бумажным и двумя полотняными фильтрами. Осадок с фильтра переносят в колбу и кипятят 30 мин с 30-кратным избытком изопропанола. Операцию повторяют трижды, декантируя раствор и добавляя новую порцию растворителя. Объединенный изопропанольный раствор кортизона обрабатывают 0,3 г активированного угля при комнатной температуре (20 ч). Уголь отфильтровывают с помощью, стеклянного пористого фильт ра № 4 и фильтрат упаривают до объема 10-15 мл. Концентрированный раствор охлаждают и выдерживают 20 ч при О С. Осадок (кортизон) отфильтровывают, промывают охлажденным изопропа98 98 95 95 НОЛОМ и сушат в вакуум-эксикаторе до постоянного веса. Из 4,85 г ацетата кортизона получают 3,6 г кортизона (82,0% от теоретического). Т. пл. 219-221е, Е 450 (в метаноле). Примесь ацетата кортизона составляет 1% и 20/ -оксипроизводного кортизона - следоше количества. Из маточного раствора путем экстракции этилацетатом и последующей перекристаллизации сьфого продукта из изопропанола дополнительно выделяют 0,15 г кортизона с Т. пл. 214-215с, -/см метаноле). Общий выход кортизона составляет 85,5% от теоретического количества. П р и м е р 3. Выращивают культуру Arthrobacter citreus ИБФМ В-51 аналогично примеру 1. Для трансформации используют клетки, отделенные от среды, ресуспендированные в водопроводной воде, в количестве 3 г/л. Стероид, микрокристаллический 21-ацетат преднизона (величина частиц 530/« ) уносят в концентрации 10 г/л. (Трансформацию осуществляютв усло|виях, аналогичных выращиванию. Через 48 ч трансформации культуральную жидкость (общий объем 200 мл: :100 мл ферментативной смеси+100 млдистиллированной воды для смыва) экстрагируют этилацетатом 4 раза по 200 мл. Раствор экстрагируют этилацетатом 4 раза по 200 мл. Раствор фильтруют через бумажный фильтр и упаривают при на роторном испарителе

до объема 5-7 мл. Концентрированный раствор преднизона охлаждают и выдерживают 20 ч при , промывают охлажденным иэопропанолом, сушат в вакуумэксикаторе до постоянного веса. Из 0,95 г ацетата преднизона получают 0,70 г преднизона (82% от теоретического количества), Т. пл. 224-220 С, 440 (в метаноле).

Примесь ацетата преднизона составляет 1% и 20 (-оксипроизводного преднизона - следы.

Из маточного раствора путем экстракции этилацетатом и перекристаллизации сырого продукта из изопропанола дополнительно выделяют 0,02 г . преднизона с Т. пл. 220-222 с. Общий

выход преднизона 0,72 г (85% от теоретического количества).

Кроме ацетата кортизона и ацетата преднизона культура Arthobacter cltreus ИБФМ В-51 осуществляет трансформацию других эфиров стероидов(табл. 2). В условиях выращивания, описанных в примере 2, для трансформации используют отмытые клетки при

биомассе 2 г/л и концентрации стероида 1 г/л. Как следует из данных хроматографического анализа выход продуктов трансформации составляет 95-100%. Результаты гидролиза различных .

эфиров стероидов культурой Arthrobacter citreus ИБФМ-51 (по данным хроматографического анализа система бензол-ацетон 3:1, силуфол ) приведены в табл. 2.

Табпица2