СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ РАСТЕНИЙ Российский патент 1994 года по МПК A01H4/00 C12N5/04 A01G31/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биотехнологии растений, и может быть использовано при приготовлении питательных сред для культивирования биотехнологических объектов.

Известен способ приготовления питательной среды для культивирования биотехнологических объектов растений, предусматривающий приготовление концентрированных растворов макросолей, микросолей, хелата железа, витаминов и других физиологически активных веществ, которые затем дозируют, разбавляют водой, дополняют углеводами, активированным углем, корректируют кислотность смеси с использованием иономера, добавляя соляную кислоту или гидрат окиси натрия, до рН 5,5 -: -5,8, соединяют с расплавом агар-агара и разливают по культуральным емкостям.

Недостатками указанного способа являются большие затраты высококвалифицированного труда и рабочего времени, низкая надежность, слабая воспроизводимость результатов вследствие неминуемых ошибок персонала при выполнении большого числа прецизионных манипуляций и самопроизвольного снижения качества концентрированных растворов в процессе хранения, а также потребность в большом количестве оборудования (холодильники для хранения концентрированных растворов, технические весы для взвешивания сахарозы, агар-агара, макросолей, активированного угля и других компонентов, аналитические весы для взвешивания микросолей, витаминов, регуляторов роста и других физиологически активных веществ, иономеры для корректировки уровня рН, автоматические дозаторы и автоматические пипетки для дозирования растворов концентрированных добавок). Кроме того, большие неудобства обусловлены необходимостью комплектования каждой биотехнологической лаборатории химическими реактивами в ассортименте 46-: -50 наименований, срок годности многих из которых ограничен.

Несколько лучшие характеристики имеет способ приготовления питательной среды, предусматривающий использование изготовленных в заводских условиях полуфабрикатов питательной среды, включающих макро- и микросоли, витамины, регуляторы роста и сахарозу, которые растворяют в воде, приготавливают навеску активированного угля, диспергируют смесь, корректируют кислотность с использованием иономера добавлением соляной кислоты или гидрата окиси натрия, отдельно делают навеску агар-агара, растворяют его при нагревании в воде, полученные смеси нагревают до 90-95^о, соединяют при тщательном перемешивании и доводят до заданного объема дистиллированной водой, после чего разливают по культуральным емкостям.

Недостатками указанного способа являются непроизводительные затраты высококвалифицированного труда и рабочего времени на приготовление навесок агар-агара, активированного угля и других компонентов, их диспергирование, раздельное растворение, корректировку кислотности, а также потребность в прецизионном оборудовании.

К слабым сторонам, присущим обоим указанным выше способам, относятся недостаточная воспроизводимость результатов, обусловленная с одной стороны ошибками персонала при выполнении процедур по дозированию компонентов и корректировке кислотности, а с другой стороны - тем обстоятельством, что в процессе корректировки кислотности среды к различным партиям среды добавляется различное количество ионов натрия (при корректировке в щелочную сторону) или ионов хлора (при корректировке кислотности в кислую сторону), которые неблагоприятно сказываются на росте и развитии биотехнологических объектов в стерильной культуре.

Весьма существенным недостатком указанных способов является то обстоятельство, что они не предусматривают учет кислотности агар-агара, поэтому конечная кислотность готовой питательной среды остается труднопредсказуемой и, в значительной степени, варьирует в зависимости от качества агар-агара.

Целью изобретения является улучшение технологических качеств готовой питательной среды, снижение затрат труда и материальных средств, а также повышение надежности биотехнологических работ.

Цель достигается тем, что централизовано, в заводских условиях, из исходных компонентов готовят сухую питательную среду с полным набором необходимых составляющих, за исключением воды, причем с целью равномерного распределения всех компонентов питательной среды, определяющих ее питательные качества и физико-химические свойства растворы исходных компонентов на этапе изготовления сухой питательной среды соединяют с носителем, способным поглощать на себя указанные компоненты и равномерно распределять их на стадиях измельчения, смешивания и фасования. После соединения содержимого фасовки с заданным количеством воды питательная среды становится пригодной для дальнейшего использования по назначению. В качестве носителя возможно использование как традиционных компонентов питательной среды, например, агар-агара, так и иных носителей - крахмала или мелкодисперсной целлюлозы, а также активных носителей, как например смесь катионита и анионита, модифицированных таким образом, что после соединения данной смеси с водой они в состоянии обеспечивать биотехнологические объекты элементами минерального питания и/или параметрами оптимальной кислотности. К числу таких веществ может относиться активированный уголь, бентонит, искусственный ионитный субстрат типа ИС-1 или ИС-2, а также цеолиты и другие вещества подобной природы. Причем, перед дегидратацией один или несколько исходных компонентов или растворов корректируют таким образом, чтобы отрицательный десятичный логарифм активности ионов оксония готовой питательной среды соответствовал требованиям биотехнологического объекта в отношении оптимальной кислотности.

П р и м е р 1. Установлено преимущество предлагаемого способа в отношении стабилизации оптимальной кислотности с учетом фактической кислотности конкретной партии агар-агара. Варианты сравнивали на фоне партий агар-агара различной степени очистки, различающихся по исходной кислотности. В качестве варианта (контроль 1) испытывали способ, взятый в качестве аналога, а в качестве варианта (контроль 2) - способ, взятый в качестве прототипа. Полученные данные изложены в табл. 1.

Эффективность способа на фоне агар-агаров разной степени.

Анализ представленных данных свидетельствует о том, что предлагаемый способ имеет преимущества даже на фоне агар-агара высокой степени очистки (бактоагар фирмы "Дифко"), но особенно заметны преимущества способа по мере снижения качества агар-агара. Весьма важно, что предлагаемый способ обеспечивает получение достаточно стабильных результатов, несмотря на значительные колебания в качестве агар-агара, т. е. повышает надежность реализации биотехнологических работ. Это объясняется тем обстоятельством, что в процессе подготовки сухой питательной среды происходит коррекция кислотности и разрыхление агар-агара.

П р и м е р 2. Определено преимущество предлагаемого способа в отношении экономии материальных средств и трудозатрат при выполнении работ по приготовлению питательной среды для выращивания биомассы женьшеня методом культуры каллусной ткани. Наименование вариантов как и в предыдущем примере. Для приготовления навесок по контрольным вариантам использовали аналитические весы R-200D, технические весы E-600, запасные растворы хранили в холодильнике "SANYO", для дозирования больших объемов концентрированных растворов использовали дозатор "Ependorf", средних объемов (1-5 мл) - дозатор "Pipetmann"; маленьких объемов (20-200 микролитра) - автоматическую пипетку "200"; измельчали исходные компоненты на мельнице "МУК-1"; кислотность корректировали с использованием иономера "И-130"; дистиллированную воду получали с использованием дистиллятора "DEM-20"; агар-агар плавили на водяной бане "LB-8"; питательную среду разогревали на электроплите. Учитывали балансовую стоимость оборудования для приготовления питательных сред и затраты труда (в стоимостном выражении) на приготовление и разлив питательной среды по культуральным емкостям. Полученные данные представлены в табл. 2.

Экономия материальных и трудовых затрат
Анализ данных табл. 2 свидетельствует о том, что использование предлагаемого способа обеспечивает существенную экономию затрат на приобретение прецизионного оборудования, а также существенно снижает затраты труда, в особенности высококвалифицированного.

П р и м е р 3. Иллюстрируется преимущество способа при использовании различных типов носителей. В качестве биотехнологического объекта использовали отселектированную каллусную ткань раувольфии змеиной. Контрольные варианты питательной среды обозначали как в примерах 1-2. Опытный вариант N 1 по предлагаемому способу с использованием в качестве носителя агар-агара, опытный вариант N 2 готовили по предлагаемому способу с использованием в качестве носителя крахмала, опытный вариант N 3 готовили по предлагаемому способу с использованием в качестве носителя карбоксиметилцеллюлозы, модифицировнной таким образом, что смесь ее катионитной и анионитной форм обеспечивала растения микроэлементами и поддерживала высокую буферную емкость на уровне рН 5,65. Полученные результаты представлены в табл. 3.

Эффективность способа на фоне различных типов носителей
Анализ полученных данных свидетельствует о преимуществах предлагаемого способа в отношении прироста биомассы. Следует также отметить, что выполнение способа по опытным вариантам 2 и 3 позволяет экономить 25% агар-агара.

Значение корректировки компонентов среды
П р и м е р 4. Иллюстрируется значение предполагаемой способом корректировки компонентов питательной среды до значения отрицательного десятичного логарифма активности ионов оксония готовой питательной среды благоприятного для биотехнологического объекта (5,65). В качестве биотехнологического объекта использовали апикальные меристемы, вычлененные из ростков картофеля сорта Домодедовский, проростков семян огурца Кечкемети ливме, почек кочанной капусты сорта Амагер и почек гибридной формы N 1836 томата.

Среды приготовлены с использованием пудрированного агар-агара. Учет результатов проводили через 60 сут после начала культивирования апикальных меристем. Полученные данные приведены в табл. 4.

Анализ данных табл. 4 свидетельствует о том, что в случае приготовления питательной среды по аналогу или прототипу фактическое значение отрицательного десятичного логарифма активности ионов гидроксония готовой питательной среды не совпадает с кислотностью жидкой составляющей питательной среды, также не соответствует оптимальному значению для биотехнологических объектов. Это обусловлено тем обстоятельством, что находящиеся в агар-агаре примеси активно смещают ионное произведение воды в щелочную сторону. Вследствие того, что аналог и прототип не предполагают определение отрицательного логарифма активности ионов оксония конкретной партии агар-агара, то в пределах аналога и прототипа практически не представляется возможным устранения отрицательного влияния указанных примесей. В то же время при реализации предлагаемого способа исходные компоненты корректируют таким образом, чтобы отрицательный десятичный логарифм активности ионов оксония готовой питательной среды соответствовал требованиям биотехнологического объекта в отношении кислотности (опытный вариант N 1).

Частным случаем из этого правила является введение в состав питательной среды компонентов, обеспечивающих высокую буферную емкость питательной среды, например, модифицированной карбоксиметилцеллюлозы, имеющей буферность на уровне рН 5,65 (опытный вариант N 2).

В случае, если не выполняются указанные условия, то эффективная реализация способа может оказаться практически невозможной (опытный вариант N 3). (56) Трофимец Л. Н. и др. Безвирусное семеноводство картофеля (рекомендации). М. : ВО "Агропромиздат", 1990, 33 с.

SIGMA. Cell culture reagents. Catalog/Price list, 1990, 248 p.

Использование: биотехнология, культивирование клеток и тканей растений, получение безвирусных клонов растений, в частности, картофеля. Сущность изобретения: при подготовке исходных компонентов их растворы соединяют с носителем и корректируют таким образом, чтобы отрицательный десятичный логарифм активности ионов оксония готовой питательной среды соответствовал требованиям биотехнологического объекта в отношении кислотности, после чего проводят их раздельную гидратацию, дегидратированные компоненты измельчают и смешивают, дозируют на порции, фасуют и для культивирования расфасованную сухую питательную среду гомогенизируют в воде и разливают в культуральные емкости. 2 з. п. ф-лы, 4 табл.

1. СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ РАСТЕНИЙ, включающий подготовку исходных компонентов, дегидратацию, дозирование на порции, фасовку сухой питательной среды, гомогенизацию ее в воде и разлив в культуральные емкости, отличающийся тем, что, с целью улучщения технологических качеств готовой питательной среды, снижения затрат труда и экономии материальных средств, при подготовке исходных компонентов их растворы соединяют с носителем, при этом один раствор или несколько растворов исходных компонентов корректируют так, чтобы отрицательный десятичный логарифм активности ионов оксония готовой питательной среды соответствовал требованиям биотехнологического объекта в отношении кислотности, дегидратации подвергают компоненты питательной среды раздельно и перед дозировкой дегидратированные исходные компоненты тщательно измельчают и смешивают. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью стабилизации кислотности готовой питательной среды, в качестве носителя используют смесь катионита и анионита. 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что смесь катионита и анионита готовят на основе карбоксиметилцеллюлозы.