СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВЫСШИХ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/14 

Изобретение относится к биотехнологии получения соматических структур, экзоклеточных ферментных систем, осуществляющих деструкцию лигно-целлюлозных субстратов, и может быть использовано в пищевой, комбикормовой и микробиологической промышленности.

Известны способы культивирования высших базидиальных грибов с целью получения клеточных соматических структур или плодовых тел /1 7/.

С целью интенсификации роста соматических структур используют разные биотехнологические процессы и различные по составу и физико-химическим свойствам питательные субстраты и среды. Известны аналоги, где в качестве стимулятора процессов биосинтеза используют 0,1 0,5% отходов производства капролактама в виде янтарной, глутаровой и адипиновой кислот /8/. Описаны способы обогащения культуральной жидкости витаминами группы B и C, а также комплексом лигнолитических ферментов при выращивании одиночных или парных культур, где в качестве источников углерода используют свекловичный жом и гидрол /9, 10/. Известно использование в питательных средах для культивирования высших базидиальных грибов экстрактов различных вторичных растительных ресурсов, злаковых культур и плодов /11/.

В целях осуществления избирательных процессов биосинтеза предусматривают введение в питательную среду отходов производства фурфурола, содержащих целлолигнин и свободный фурфурол в соотношении 42:1 /12/, а также фенольных соединений, представляющих группу флавоноидов, получаемых экстрагированием отходов растительного сырья лузги подсолнечника, стеблей гречихи или цветов сальвии /13/.

В целях интенсификации биологических процессов накопления биомассы, клеточных и внеклеточных физиологически активных соединений используют как один из наиболее распространенных способ стабилизации оптимальных значений концентрации водородных ионов в питательных средах. Так, при наличии в питательных средах высоких значений активной кислотности /pH 3,5 5,0/ известен способ снижения кислотности путем прибавления гашеной извести или мела в воду, используемую для увлажнения сыпучих и твердых субстратов /3/. Указанный способ подготовки питательных сред для культивирования базидиальных грибов наиболее близок по технической сущности к заявляемому изобретению, принят нами в качестве прототипа.

Несмотря на широкую распространенность указанного способа, его нельзя признать универсальным и многоцелевым, поскольку реализация этого способа хотя и приводит к процессам интенсификации твердофазной ферментации, имеет узкоспецифическую цель снижение активной кислотности до оптимальных значений физиологического роста.

Целью настоящего изобретения являются интенсификация и удешевление технологического процесса, создание буферной емкости среды, препятствующей повышению активной кислотности, улучшение структуры субстрата и динамики диффузионных процессов, а также увеличение водоудерживающей способности субстрата.

Поставленная цель достигается тем, что культивирование базидиомицетов осуществляют методом твердофазной ферментации вторичных растительных субстратов, увлажненных до 65 75% содержащих в качестве интенсификатора биосинтетической активности 1 2% фильтрационного осадка, получаемого при дефекации диффузионного сока сахарной свеклы.

Использование фильтрационного осадка /ФО/ при культивировании высших базидиомицетов, биохимические и количественные показатели которого характеризуются данными, приведенными в табл. 1, имеет ряд биотехнологических преимуществ по сравнению с применением технологии по прототипу, в частности
наряду с преобладающим наличием окиси кальция и его гидратов в ФО содержатся ряд микроэлементов и важные физиологически активные соединения, присущие белковому компоненту сахарной свеклы;
наличие ФО приводит к улучшению структуры субстрата путем агрегации коллоидных частиц, увеличению водоудержавающей способности и уменьшению степени пересыхания;
окись кальция и его гидраты, содержащиеся в ФО, снижают неблагоприятное воздействие высоких концентраций калия, магния, натрия и фосфора;
наличие в ФО сорбированного и спонтанно выделяемого в процессе культивирования CO₂ благоприятно влияет на синтез органических кислот благодаря гетеротрофной фиксации углекислого газа мицелием;
ФО является бросовым продуктом сахарного производства, транспортабельный без тарной упаковки и не подвергается существенным химическим изменениям в процессе длительного хранения.

Конкретная биотехнологическая сущность настоящего изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример N 1.

Определение оптимальной концентрации фильтрационного осадка при твердофазном культивировании на примере виноградных выжимок, обладающих высокой естественной кислотностью.

Виноградные выжимки насыпали в пробирки слоем различной высоты, добавляли воды из расчета 65 75% влажности, вносили фильтрационный осадок и стерилизовали острым паром 30 мин при 0,1 МПа. После остывания засевали чистой культурой Pleurotus ostreatus ИБК-1019. Как следует из табл. 2, в которой приведены результаты опыта, оптимальные значения pH среды для роста вешенки достигаются при внесении в виноградные выжимки 1 2% фильтрационного осадка, что приводит к достижение pH 5,8 6,9. Дальнейшее повышение концентрации нецелесообразно, так как изменения pH незначительные и не являются оптимальными для роста высших базидиальных грибов.

Пример N 2. Определение линейной скорости роста культур базидиомицетов, характеризующей скорость обрастания субстрата в режиме технологического процесса. Субстрат виноградные выжимки вносили в чашки Петри, увлажняли, добавляли фильтрационный осадок и стерилизовали согласно примеру N 1. Посев культур безидиомицетов осуществляли в центр чашки мицелиальным диском диаметром 0,5 см, вырезанным пробковым сверлом из колонии гриба в чашке Петри на сусло-агаре. Диаметр колонии замеряли через определенные промежутки времени. Результаты исследования приведены в табл. 3.

Из приведенных результатов следует, что стимулирующее действие на рост мицелия от внесения фильтрационного осадка колеблется в широких пределах, однако достаточный технологический эффект достигается при дозе 1 2%
Пример N 3.

В целях выбора оптимальных концентраций фильтрационного осадка, для получения максимальных значений активности оксидаз в условиях твердофазного культивирования высших базидиомицетов осуществляли твердофазное культивирование Pleurotus ostreatus, ИБК-1019. Для твердофазной ферментации виноградные выжимки помещают в пробирки и готовят к посеву согласно примеру N 1. Засев проводили чистой культурой Pleurotus ostreatus, ИБК-1019, срок культивирования 10 сут. Экстракцию ферментов проводили 0,25 М раствором хлористого натрия в течение 3 ч, отфильтровывали и проводили диализ для избавления от солей. Результаты представлены на 1 г сухого субстрата с мицелием. Результаты исследований приведены в табл. 4.

Как следует из табл. 4, фильтрационный осадок существенно способствует быстрому прорастанию мицелия на всю глубину субстрата, активному образованию воздушного мицелия и значительно интенсифицирует процесс ферментообразования, в частности, монофенолмонооксигеназы. Максимальные значения активности монофенолмонооксигеназы получены при наличии в питательной среде 1,0 2,0% ФО, что сопровождается обильным образованием воздушного мицелия и повышением скорости обрастания субстрата при твердофазной ферментации.

Пример N 4.

Для расширения использованных субстратов для культивирования высших базидиальных грибов с добавками фильтрационного осадка использовали кроме виноградных выжимок пшеничное зерно и свекловичный жом. Пшеничное зерно является стандартным субстратом для промышленного получения посевного мицелия, его готовили согласно стандартной методике /14/. Виноградные выжимки и свекловичный жом готовили аналогично примеру N 1. В контроль везде добавляли мел и гипс согласно указанным источникам /3, 14/, в опытных вариантах ФО использовали в концентрациях 1,0; 3,0; 5,0% Штамм Pleurotus ostreatus ИБК-1019 культивировали в емкостях 200 мл (табл. 5).

Как видно из полученных результатов, независимо от используемого субстрата применение фильтрационного осадка стимулирует рост мицелия гриба.

Пример N 5.

Влияние фильтрационного осадка на плодоношение Pleurotus ostreatus ИБК-1019.

Виноградные выжимки готовили для твердофазной ферментации и засевали согласно примеру N 1 в емкостях 1 л. Результаты опыта представлены в табл. 6.

Из полученных результатов следует, что внесение в субстрат 1 2% фильтрационного осадка увеличивает урожайность вешенки более чем в два раза, кроме того, благодаря стимулирующему действию его на скорость роста мицелия срок плодоношения в опытном варианте с 1 2% фильтрационного осадка сокращается примерно вдвое.

Таким образом, приведенные примеры экспериментальной проверки предложенного способа подтверждают достижение поставленной цели.

Анализ сравнительных показателей практической реализации предложенного способа культивирования высших базидиомицетов позволяет утверждать, что он существенно отличается от известных ранее технологических приемов культивирования высших базидиальных грибов и соответствует критерию "Новизна". При изучении других известных решений в данной области биотехнологии признаки, отличающие заявляемое изобретение от прототипа, не были выявлены, что обеспечивает заявляемому биотехнологическому решению соответствие критерию "Существенные отличия".

Источники информации
1. Беккер З. Э. Физиология грибов и их практическое использование. М. Изд. МГУ, 1963, 268 с.

2. Частухин В.Я. Николаевская М.А. Биологический распад и ресинтез органических веществ. Л. Наука, 1969, 319 с.

3. Дудка И.А. Гиепа В.В. Вассер С.П. и др. Вешенка обыкновенная. Киев: Наукова думка, 1976, 78 с.

4. Промышленное культивирование съедобных грибов. Дудка И.А. Вассер С.П. Бухало А.С. и др. Киев: Наукова думка, 1978, 264 с.

5. Высшие съедобные базидиомицеты в поверхностной и глубинной культуре. Бисько Н.А. Бухало А.С. Вассер С.П. и др. Киев: Наукова думка, 1983, 312 с.

6. Бекер М.Е. Швинка Ю.Э. Лука В.Т. и др. Трансформация продуктов фотосинтеза. Рига: Изд. Зинатне, 1984, 218 с.

7. Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. Киев: Наукова думка, 1988, 144 с.

8. А. с. СССР N 874755. Способ культивирования высших базидиальных грибов. Яровенко В. П. Даниляк Н.И. Мельничук Г.Г. и др. Заявка N 2606871 от 12.04.78, кл. C 12 N 9/14.

9. А.с. СССР N 749090. Способ гидролиза растительного сырья. Яровенко В. П. Даниляк Н. И. Мельничук Г.Г. Заявка N 2711371 от 10.01.79, кл. C 12 D 13/02, C 13 K 1/06.

10. А.с. СССР N 1103551. Способ получения комплекса линголитических ферментов. Семичаевский В. Д. Даниляк Н.И. Портнова Л.В. Заявка N 3462784 от 15.03.84, кл. C 12 N 9/00.

11. Даниляк Н. И. Семичаевский В.Д. Дудченко Л.Г. Трутнева И.А. Ферментные системы высших базидиальных грибов. Киев: Наукова думка, 1989, 320 с.

12. А. с. СССР N 1084299. Способ получения комплекса внеклеточных ферментов. Семичаевский В. Д. Даниляк Н.И. Трутнева И.А. Заявка N 3520061 от 08.12.82, кл. C 12 N 9/02, C 12 N 1/14.

13. А. с. СССР N 1137758. Способ получения комплекса ферментов. Семичаевский В.Д. Даниляк Н.И. Мельничук Г.Г. и др. Заявка N 3586762 от 05.05.83, кл. C 12 N 9/02, C 12 N 1/14.

14. Методические рекомендации по промышленному культивированию съедобных грибов. Киев: Наукова думка, 1984, 109 с.

Использование: биотехнология, комбикормовая и пищевая промышленность. Сущность изобретения: культивирование проводят методом твердофазной ферментации растительных субстратов, используя в качестве интенсификатора биосинтетической активности 1 - 2 мас.% фильтрационного осадка, получаемого при дефекации диффузионного сока сахарной свеклы. Способ обеспечивает увеличение прироста биомассы, активности окислительных ферментов, глубины конверсии субстрата, урожайности плодовых тел. 6 табл.

Способ твердофазного культивирования высших базидиальных грибов-продуцентов клеточных соматических структур или плодовых тел и окислительных ферментных систем на увлажненном вторичном растительном субстрате до максимального накопления целевого продукта, отличающийся тем, что культивирование осуществляют на вторичном растительном субстрате, увлажненном до 65 75% содержащем в качестве интенсификатора биосинтетической активности 1 2 мас. фильтрационного осадка, получаемого при дефекации диффузионного сока сахарной свеклы.