СПОСОБ ПЛАЗМИДНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА Российский патент 1994 года по МПК C12N15/00 C12N1/20 

Описание патента на изобретение RU2005787C1

Изобретение относится к молекулярной генетике, в частности к получению компетентных клеток Bac. anthracis, которые могут быть использованы для введения, клонирования и изучения экспрессии генетического материала.

Известен способ трансформации сибиреязвенного микроба, заключающийся в том, что клетки возбудителя обрабатываются ферментом N-ацетилмурамидазой, после чего добавляется плазмидная ДНВ и отбираются клоны с частотой 102КОЕ/1 мкг ДНК.

Низкая частота трансформации клеток сибиреязвенного микроба, а также необходмиость использования в данной методике не производящего в СССР N-ацетилмурамидазы явились основанием для разработки метода криотрансформации.

Однако частота трансформации, полученной этим способом, также низкая.

Наиболее близким к достигаемому результату является способ трансформации вегетативных клеток сибиреязвенного микроба, заключающийся в электропорации или электротрансформации плазмидной ДНК. Максимальная частота трансформации при помощи этого способа составляет 2,6 ˙104КОЕ/мкг ДНК.

Однако этот способ требует привлечения дорогостоящего прибора, выход трансформантов также недостаточно высок.

Цель изобретения - упрощение способа и повышение частоты трансформации указанного микроорганизма.

Цель достигается тем, что перед обработкой лизоцимом и плазмидной ДНК клетки Bac. abthracis выращивают в жидкой питательной среде А следующего состава: (на 1 л) (NH4)2SO4 1,8-2-2г; K2HPO4˙3H2O 18,1-18,5г; KH2PO4 5,8-6,2г; Na3C8H5O7˙5H2O 0,8-1,2г; MgSO4˙7H2O 0,15-0,25г казаминокислоты (Difco) 0,15-0,25г; дрожжевой экстракт (Difco) 0,8-1,2г; рН 7,1-7,3.

Использованная среда близка по составу среде, которая ранее использовалась при трансформации клеток сенной палочки. Однако применение среды Spizizеn для достижения трансформации сибиреязвенного микроба не дало положительных результатов.

Известно использование лизоцима для протопластной трансформации клеток различных бацилл.

Однако применение этого фермента при трансформации клеток сибиреязвенного микроба не позволило получить компетентных клеток этого микроорганизма.

Сущность способа заключается в следующем.

Выращенную на жидкой питательной среде А культуру осаждают и клетки обрабатывают лизоцимом в концентрации 5-20 мг/мл. В результате такой обработки образуется смесь вегетативных клеток, сферопластов и протопластов. Дальнейшую обработку проводят по методу Chang s Cohen. Полученные таким способом клетки трансформируются плазмидными ДНК с высокой эффективностью (104-105/мкг ДНК) в зависимости от используемого вектора и концентрации лизоцима. В качестве реципиентов при трансформации использовали вирулентный и вакцинный штаммы возбудителя сибирской язвы. В качестве векторов для трансформации сибиреязвенного микроба использовали плазмиды рВС и рИВ 110. Максимальная частота наблюдалась при концентрации 10 мг/мл и использовании плазмиды рИВ 110.

П р и м е р 1. Для культивирования клеток Bac. anthracis (вирулентный штамм ч-7) используют среду следующего состава: (на 1 л) (NH4)2SO4 1,8г; К2НРО4˙3Н2О 18,1г; КН2РО4- 5,8; Na3C8H5O7˙5H2O 0,8г; MgSO4˙7H2O 0,15г; казаминокислоты (Difco) 0,15г дрожжевой экстракт (Difco) 0,8г рН 7,1. Клетки выращивают в течение 16-20 ч в объеме 100 мл при посевной дозе 103-104 КОЕ/мл. Пробы по 15 мл центрифугируют 15 мин при 10000g и осадок ресуспендируют в 1 мл среды SMML следующего состава: 2x SMM (на 1 л - сахароза 342 г, малеат натрия 4,72г, MgCl2 8,12г, рН 6,5). К указанному буферу добавляется равное количество бульона: (на 1 л) триптон, дрожжевой экстракт 5 г, NaCl 10 г, рН 7,2. К полученной суспензии клеток добавляют лизоцим, растворенный до конечной концентрации 5 мг/мл, т. е. к 1 мл ресуспендированных клеток добавляют 10 мг лизоцима, растворенного в 1 мл SMML. Полученную смесь инкубируют при 37оС с мягким покачиванием в течение 2 ч. После инкубации в смесь добавляют 10 мл SMML, перемешивают и центрифугируют при 10000g в течение 15 мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл SMML.

В компетентную смесь вегетативных клеток, сферопластов и протопластов добавляют 5 нг плазмиды рВС 16 в 10 мкл ТЕ буфера (трисHCl 10 мМ, 1 мМ ЭДТА, рН 7,6), и 1,5 мл 40% -ного раствора полиэтиленгликоля (мол. м. 6000). Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин, затем добавляют 10 мл SMML, перемешивают и центрифугируют 15 мин при 10000g. Осадок ресуспендируют в1 мл SMML и суспензию инкубируют при 37оС в течение 2 ч. После этого аликвоты по 0,1 мл наносят на чашки со средой ДМ-3: (на 1 л) 500 мл 1 М сахарозы (рН 7,3), 50 мл 10% дрожжевого экстракта (Difco), 100 мл 5% казаминокислот (Difco), 100 мл фосфатного буфера (3,5 К2НРО4 и 1,5% КН2РО4, рН 7,3), 25 мл 20% раствора глюкозы, 20 мл 1М раствора MgCl2, 5 мл 2% раствора БСА (Bovinum serum albumin, Serva), 200 мл 4% агара. Рост колоний наблюдаются через 24-48 ч инкубации при 37оС. Частота в данном примере составляет 5˙104 трансформантов/1 мкг ДНК.

П р и м е р 2. Ддя культивирования клеток Bac. anthracis (штамм СТИ-1) используют среду следующего состава (на 1 л) (NH4)2SO4 2,2г; К2НРО4˙3Н2О 18,5; КН2РО46,2г; Na3C8H5O7˙5H2O 1,2г; MgSO4˙7H2O 0,2г, казаминокислоты (Difco) 0,25г, дрожжевой экстракт (Difco) 1,2г, рН 7,3. Клетки выращивают в течение 20 ч в объеме 100 мл при посевной дозе 104КОЕ/мл. Пробы по 15 мл центрифугируют при 10000g в течение 15 мин и осадок ресуспендируют в 1 мл SMML (состав приведен в предыдущем примере). К полученной суспензии клеток добавляют лизоцим, конечная концентрация которого составляет 20 мг/мл (к 1 мл ресуспендированных клеток добавляют 40 мг лизоцима, растворенного в 1 мл SMML. Полученную смесь инкубируют с мягким покачиванием в течение 1,5 ч. После инкубации в смесь добавляют 10 мл SMML, перемешивают и центрифугируют при 10000g в течение 15 мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл SMML.

В компетентную смесь добавляют 10 нг плазмиды рИВ 110 в 10 мкл ТЕ буфера и 1,5 мл 40% раствора полиэтиленгликоля. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин, затем добавляют 10 мл SMML, перемешивают и центрифугируют в течение 15 мин при 10000g. Осадок ресуспендируют в 1мл SMML и суспензию инкубируют при 37оС в течение 2 ч. После этого аликвоты по 0,1 мл наносят на чашки со средним ДМ-3 с добавлением кенамицина в дозе 40-60 мкг/мл. Рост колоний наблюдают через 24 ч инкубации при 37оС, Частота составляет 2.104 трансформантов/мкг ДНК.

П р и м е р 3. В качестве реципиента используют штамм СТИ ПР, который выращивают в среде следующего состава: (на 1 л) (NH4)2SO4 2г; К2НРО4. 3Н2О 18,3г; КН2РО4 6г; Na3C8H5O7. 5H2O 1г; MgSO4 ˙7H2O 0,2г, казаминокислоты 0,2г; дрожжевой экстракт 1г; рН 7,2, в течение 20 ч при посевной дозе 104КОЕ/мл. Отбирают пробы по 15 мл, центрифугируют 15 мин при 10000g и осадок ресуспендируют в 1мл SMML. К суспензии добавляют лизоцим в конечной концентрации 10 мг/мл (к 1 мл клеток добавляют 20 мг лизоцима, растворенного в 1 мл SMML). Полученную смесь инкубируют при 37оС с мягким покачиванием в течение 1,5 с. После инкубации в смесь добавляют 10 мл SMML, перемешивают и центрифугируют при 10000g в течение 15 мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл SMML.

В полученную компетентную смесь добавляют 10 нг плазмиды рИВ 110 в 10 мкл ТЕ буфера и 1,5 мл 40% раствора полиэтилегликоля. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин, затем добавляют 10 мл SMML, перемешивают и центрифугируют 15 мин при 10000g. Осадок ресуспендируют в 1 мл SMML и суспензию инкубируют при 37оС в течение 2 ч. После этого аликвоты по 0,1 мл наносят на чашки со средой ДМ-3 с добавлением канамицина в дозе 40 мкг/мл. Рост колоний наблюдают через 24 ч инкубации при 37оС. Частота трансформации достигает в данном примере 5˙ 105 трансформантов/1 мкг ДНК.

Как видно из представленных примеров, максимальная частота трансформации различных штаммов сибиреязвенного микроба плазмидными ДНК предложенным нами способом - 5˙105 трансформантов/1 мкг ДНК. (56) S. Makino, S. Sasakawa, J. Uchida, N. Terakado and K. Yoshikawa. Transformation of a cloning vector pUB 110into Bac. anthracis//FEMS Microbiol. Let. - 1987. - Vol. 44. - No. 1. - p. 45-48.

A. S. Stepanov, O. B. Pusanova, S. Ya. Dityatkin, O. G. Loginova, B. N. Jlashenko. Glycine-induced cryotransformation of pplasmid into Bac. anthracis//J. Gen. Microbiol. - 1990. - Vol. 136. - p. 1217-1221.

C. P. Qwinn and B. N. Dancer. Transformation of vegetative cells of Bac. anthracis with plasmid DNA//J. Gen. Microbiol. - 1990. - Vol. 136. - p. 1211-1215.

J. Spizizen. Transformation of biochemically defitient strains of Bac. subtilis by deoxyribonucleate//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1958. - Vol. 44. -No. 7. -p. 1072-1078.

C. Anagnostopulos, J. Spizizen. Requirements for transformation in Bac. subtilis. //J. Bacteriol. - 1961. - Vol. 81. - No. 5. - p. 741-746.

S. Chang and S. Cohen. High frequency transformstion of Bac. subtilis protoplasts by plasmid DNA. //Molec. Gen. Gen. - 1979. - Vol. 168. - p. 111-115.

Похожие патенты RU2005787C1

название год авторы номер документа
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PRO PF 5, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ СИНТЕЗ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА FI ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ И ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ, И СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК PRO PF5 1995
  • Алимов А.П.
  • Павлов В.М.
RU2110575C1
Векторная плазмидная ДНК poLYA15, предназначенная для клонирования чужеродных генов в клетках ЕSснеRIснIа coLI и BacILLUS SPP., и способ его конструирования 1987
  • Шевченко Д.В.
  • Добрица А.П.
SU1476896A1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PZAT1, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ДНК-ЗОНДА, С ПОМОЩЬЮ КОТОРОГО ИДЕНТИФИЦИРУЮТ ТОКСИГЕННЫЕ ШТАММЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ, СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК PZAT1 И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК PZAT1 И ДНК-ЗОНДА, С ПОМОЩЬЮ КОТОРОГО ИДЕНТИФИЦИРУЮТ ТОКСИГЕННЫЕ ШТАММЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ 1992
  • Тимошин В.Б.
  • Замараев В.С.
  • Антонов В.А.
RU2037520C1
АСПОРОГЕННЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Bacillus anthracis 55ΔТПА-1Spo(pUB110PA-1)-ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА 2006
  • Микшис Наталья Ивановна
  • Попов Юрий Алексеевич
  • Шулепов Дмитрий Викторович
RU2321629C1
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Bacillus anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110PA-1)-ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА 2006
  • Микшис Наталья Ивановна
  • Попов Юрий Алексеевич
  • Кудрявцева Ольга Михайловна
RU2321628C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBANP 464, КОДИРУЮЩАЯ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗУ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS A-50 И ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS - ПРОДУЦЕНТ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ. 1989
  • Йомантас Ю.В.
  • Гервинскас В.В.
  • Народицкая В.А.
  • Козлов Ю.И.
  • Уланова Т.И.
  • Стеркин В.Э.
  • Стронгин А.Я.
  • Изотова Л.С.
  • Дебабов В.Г.
RU1679800C
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ BACILLUS ANTHRACIS 1995
  • Абгарян А.Г.
  • Майский В.Г.
  • Еременко Е.И.
RU2101354C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНКРTV241, СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНКРTV241, СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПЛАЗМИДЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ ГЕН CRY III A В СОСТАВЕ ТРАНСПОЗОНА TN917CAT, ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP. THURINGIENSIS, АКТИВНЫЙ ПРОТИВ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА 1995
  • Добрица А.П.
RU2125091C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК РВТN II, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ СИНТЕЗ КРИСТАЛЛИЧЕСКОГО ИНСЕКТИЦИДНОГО ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА CRY IIIA-ТИПА, СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS PUTIDA, СОДЕРЖАЩИЙ РЕКОМБИНАНТНУЮ ПЛАЗМИДУ ДНК РВТN II-ПРОДУЦЕНТ КРИСТАЛЛИЧЕСКОГО ИНСЕКТИЦИДНОГО ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА CRY IIIA-ТИПА, АКТИВНОГО ПРОТИВ НАСЕКОМЫХ ОТРЯДА COLEOPTERA 1995
  • Добрица А.П.
  • Корецкая Н.Г.
  • Кочетков В.В.
  • Светоч О.Е.
  • Лосева О.И.
RU2103363C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PTHY 315, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК α -ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ -ТИМОЗИН a 1992
  • Шмелев В.А.
  • Коробко В.Г.
RU2077586C1

Реферат патента 1994 года СПОСОБ ПЛАЗМИДНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА

Использование: плазмидная трансформация, сибиреязвенный микроб. Сущность изобретения: в качестве реципиента плазмидной ДНК используют клетки сибиреязвенного микроба, выращенные в среде, содержащей на 1 л воды (NH4)2SO4 1,8 - 2,2 г; K2HPO4×3H2O 18,1 - 18,5 г; KH2PO4 5,8 - 6,2 г; Na3C8H5O7×5H2O 0,8 - 1,2 г; MgSO4×7H2O 0,15 - 0,25 г; казаминокислоты 0,15 - 0,25 г; дрожжевой экстракт 0,8 - 1,2 г, рН 7,1 - 7,3, и обработанные лизоцимом. Максимальная частота трансформации клеток составляет 5×105 трансформантов/мкг ДНК. Изобретение позволяет упростить способ и повысить частоту трансформации.

Формула изобретения RU 2 005 787 C1

СПОСОБ ПЛАЗМИДНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА путем их обработки лизоцимом, отличающийся тем, что перед обработкой клетки сибиреязвенного микроба выращивают в среде, содержащей, г/1 л воды:
(NH4)2SO4 1,8 - 2,2
K2HPO · 3H2O 18,1 - 18,5
KH2PO4 5,8 - 6,2
Na3C8H5O7 · 5H2O 0,8 - 1,2
MgSo4 · 7H2O 0,15 - 0,25
Казаминокислоты 0,15 - 0,25
Дрожжевой экстракт pH 7,1 - 7,3. 0,8 - 1,2

RU 2 005 787 C1

Авторы

Померанцев А.П.

Мохов Ю.В.

Даты

1994-01-15Публикация

1991-07-24Подача