СПОСОБ ПЛАЗМИДНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА Российский патент 1994 года по МПК C12N15/00 C12N1/20 

Изобретение относится к молекулярной генетике, в частности к получению компетентных клеток Bac. anthracis, которые могут быть использованы для введения, клонирования и изучения экспрессии генетического материала.

Известен способ трансформации сибиреязвенного микроба, заключающийся в том, что клетки возбудителя обрабатываются ферментом N-ацетилмурамидазой, после чего добавляется плазмидная ДНВ и отбираются клоны с частотой 10²КОЕ/1 мкг ДНК.

Низкая частота трансформации клеток сибиреязвенного микроба, а также необходмиость использования в данной методике не производящего в СССР N-ацетилмурамидазы явились основанием для разработки метода криотрансформации.

Однако частота трансформации, полученной этим способом, также низкая.

Наиболее близким к достигаемому результату является способ трансформации вегетативных клеток сибиреязвенного микроба, заключающийся в электропорации или электротрансформации плазмидной ДНК. Максимальная частота трансформации при помощи этого способа составляет 2,6 ˙10⁴КОЕ/мкг ДНК.

Однако этот способ требует привлечения дорогостоящего прибора, выход трансформантов также недостаточно высок.

Цель изобретения - упрощение способа и повышение частоты трансформации указанного микроорганизма.

Цель достигается тем, что перед обработкой лизоцимом и плазмидной ДНК клетки Bac. abthracis выращивают в жидкой питательной среде А следующего состава: (на 1 л) (NH₄)₂SO₄ 1,8-2-2г; K₂HPO₄˙3H₂O 18,1-18,5г; KH₂PO₄ 5,8-6,2г; Na₃C₈H₅O₇˙5H₂O 0,8-1,2г; MgSO₄˙7H₂O 0,15-0,25г казаминокислоты (Difco) 0,15-0,25г; дрожжевой экстракт (Difco) 0,8-1,2г; рН 7,1-7,3.

Использованная среда близка по составу среде, которая ранее использовалась при трансформации клеток сенной палочки. Однако применение среды Spizizеn для достижения трансформации сибиреязвенного микроба не дало положительных результатов.

Известно использование лизоцима для протопластной трансформации клеток различных бацилл.

Однако применение этого фермента при трансформации клеток сибиреязвенного микроба не позволило получить компетентных клеток этого микроорганизма.

Сущность способа заключается в следующем.

Выращенную на жидкой питательной среде А культуру осаждают и клетки обрабатывают лизоцимом в концентрации 5-20 мг/мл. В результате такой обработки образуется смесь вегетативных клеток, сферопластов и протопластов. Дальнейшую обработку проводят по методу Chang s Cohen. Полученные таким способом клетки трансформируются плазмидными ДНК с высокой эффективностью (10⁴-10⁵/мкг ДНК) в зависимости от используемого вектора и концентрации лизоцима. В качестве реципиентов при трансформации использовали вирулентный и вакцинный штаммы возбудителя сибирской язвы. В качестве векторов для трансформации сибиреязвенного микроба использовали плазмиды рВС и рИВ 110. Максимальная частота наблюдалась при концентрации 10 мг/мл и использовании плазмиды рИВ 110.

П р и м е р 1. Для культивирования клеток Bac. anthracis (вирулентный штамм ч-7) используют среду следующего состава: (на 1 л) (NH₄)₂SO₄ 1,8г; К₂НРО₄˙3Н₂О 18,1г; КН₂РО₄- 5,8; Na₃C₈H₅O₇˙5H₂O 0,8г; MgSO₄˙7H₂O 0,15г; казаминокислоты (Difco) 0,15г дрожжевой экстракт (Difco) 0,8г рН 7,1. Клетки выращивают в течение 16-20 ч в объеме 100 мл при посевной дозе 10³-10⁴ КОЕ/мл. Пробы по 15 мл центрифугируют 15 мин при 10000g и осадок ресуспендируют в 1 мл среды SMML следующего состава: 2x SMM (на 1 л - сахароза 342 г, малеат натрия 4,72г, MgCl₂ 8,12г, рН 6,5). К указанному буферу добавляется равное количество бульона: (на 1 л) триптон, дрожжевой экстракт 5 г, NaCl 10 г, рН 7,2. К полученной суспензии клеток добавляют лизоцим, растворенный до конечной концентрации 5 мг/мл, т. е. к 1 мл ресуспендированных клеток добавляют 10 мг лизоцима, растворенного в 1 мл SMML. Полученную смесь инкубируют при 37^оС с мягким покачиванием в течение 2 ч. После инкубации в смесь добавляют 10 мл SMML, перемешивают и центрифугируют при 10000g в течение 15 мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл SMML.

В компетентную смесь вегетативных клеток, сферопластов и протопластов добавляют 5 нг плазмиды рВС 16 в 10 мкл ТЕ буфера (трисHCl 10 мМ, 1 мМ ЭДТА, рН 7,6), и 1,5 мл 40% -ного раствора полиэтиленгликоля (мол. м. 6000). Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин, затем добавляют 10 мл SMML, перемешивают и центрифугируют 15 мин при 10000g. Осадок ресуспендируют в1 мл SMML и суспензию инкубируют при 37^оС в течение 2 ч. После этого аликвоты по 0,1 мл наносят на чашки со средой ДМ-3: (на 1 л) 500 мл 1 М сахарозы (рН 7,3), 50 мл 10% дрожжевого экстракта (Difco), 100 мл 5% казаминокислот (Difco), 100 мл фосфатного буфера (3,5 К₂НРО₄ и 1,5% КН₂РО₄, рН 7,3), 25 мл 20% раствора глюкозы, 20 мл 1М раствора MgCl₂, 5 мл 2% раствора БСА (Bovinum serum albumin, Serva), 200 мл 4% агара. Рост колоний наблюдаются через 24-48 ч инкубации при 37^оС. Частота в данном примере составляет 5˙10⁴ трансформантов/1 мкг ДНК.

П р и м е р 2. Ддя культивирования клеток Bac. anthracis (штамм СТИ-1) используют среду следующего состава (на 1 л) (NH₄)₂SO₄ 2,2г; К₂НРО₄˙3Н₂О 18,5; КН₂РО₄6,2г; Na₃C₈H₅O₇˙5H₂O 1,2г; MgSO₄˙7H₂O 0,2г, казаминокислоты (Difco) 0,25г, дрожжевой экстракт (Difco) 1,2г, рН 7,3. Клетки выращивают в течение 20 ч в объеме 100 мл при посевной дозе 10⁴КОЕ/мл. Пробы по 15 мл центрифугируют при 10000g в течение 15 мин и осадок ресуспендируют в 1 мл SMML (состав приведен в предыдущем примере). К полученной суспензии клеток добавляют лизоцим, конечная концентрация которого составляет 20 мг/мл (к 1 мл ресуспендированных клеток добавляют 40 мг лизоцима, растворенного в 1 мл SMML. Полученную смесь инкубируют с мягким покачиванием в течение 1,5 ч. После инкубации в смесь добавляют 10 мл SMML, перемешивают и центрифугируют при 10000g в течение 15 мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл SMML.

В компетентную смесь добавляют 10 нг плазмиды рИВ 110 в 10 мкл ТЕ буфера и 1,5 мл 40% раствора полиэтиленгликоля. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин, затем добавляют 10 мл SMML, перемешивают и центрифугируют в течение 15 мин при 10000g. Осадок ресуспендируют в 1мл SMML и суспензию инкубируют при 37^оС в течение 2 ч. После этого аликвоты по 0,1 мл наносят на чашки со средним ДМ-3 с добавлением кенамицина в дозе 40-60 мкг/мл. Рост колоний наблюдают через 24 ч инкубации при 37^оС, Частота составляет 2.10⁴ трансформантов/мкг ДНК.

П р и м е р 3. В качестве реципиента используют штамм СТИ ПР, который выращивают в среде следующего состава: (на 1 л) (NH₄)₂SO₄ 2г; К₂НРО₄. 3Н₂О 18,3г; КН₂РО₄ 6г; Na₃C₈H₅O₇. 5H₂O 1г; MgSO₄ ˙7H₂O 0,2г, казаминокислоты 0,2г; дрожжевой экстракт 1г; рН 7,2, в течение 20 ч при посевной дозе 10⁴КОЕ/мл. Отбирают пробы по 15 мл, центрифугируют 15 мин при 10000g и осадок ресуспендируют в 1мл SMML. К суспензии добавляют лизоцим в конечной концентрации 10 мг/мл (к 1 мл клеток добавляют 20 мг лизоцима, растворенного в 1 мл SMML). Полученную смесь инкубируют при 37^оС с мягким покачиванием в течение 1,5 с. После инкубации в смесь добавляют 10 мл SMML, перемешивают и центрифугируют при 10000g в течение 15 мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл SMML.

В полученную компетентную смесь добавляют 10 нг плазмиды рИВ 110 в 10 мкл ТЕ буфера и 1,5 мл 40% раствора полиэтилегликоля. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин, затем добавляют 10 мл SMML, перемешивают и центрифугируют 15 мин при 10000g. Осадок ресуспендируют в 1 мл SMML и суспензию инкубируют при 37^оС в течение 2 ч. После этого аликвоты по 0,1 мл наносят на чашки со средой ДМ-3 с добавлением канамицина в дозе 40 мкг/мл. Рост колоний наблюдают через 24 ч инкубации при 37^оС. Частота трансформации достигает в данном примере 5˙ 10⁵ трансформантов/1 мкг ДНК.

Как видно из представленных примеров, максимальная частота трансформации различных штаммов сибиреязвенного микроба плазмидными ДНК предложенным нами способом - 5˙10⁵ трансформантов/1 мкг ДНК. (56) S. Makino, S. Sasakawa, J. Uchida, N. Terakado and K. Yoshikawa. Transformation of a cloning vector pUB 110into Bac. anthracis//FEMS Microbiol. Let. - 1987. - Vol. 44. - No. 1. - p. 45-48.

A. S. Stepanov, O. B. Pusanova, S. Ya. Dityatkin, O. G. Loginova, B. N. Jlashenko. Glycine-induced cryotransformation of pplasmid into Bac. anthracis//J. Gen. Microbiol. - 1990. - Vol. 136. - p. 1217-1221.

C. P. Qwinn and B. N. Dancer. Transformation of vegetative cells of Bac. anthracis with plasmid DNA//J. Gen. Microbiol. - 1990. - Vol. 136. - p. 1211-1215.

J. Spizizen. Transformation of biochemically defitient strains of Bac. subtilis by deoxyribonucleate//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1958. - Vol. 44. -No. 7. -p. 1072-1078.

C. Anagnostopulos, J. Spizizen. Requirements for transformation in Bac. subtilis. //J. Bacteriol. - 1961. - Vol. 81. - No. 5. - p. 741-746.

S. Chang and S. Cohen. High frequency transformstion of Bac. subtilis protoplasts by plasmid DNA. //Molec. Gen. Gen. - 1979. - Vol. 168. - p. 111-115.

Использование: плазмидная трансформация, сибиреязвенный микроб. Сущность изобретения: в качестве реципиента плазмидной ДНК используют клетки сибиреязвенного микроба, выращенные в среде, содержащей на 1 л воды (NH₄)₂SO₄ 1,8 - 2,2 г; K₂HPO₄×3H₂O 18,1 - 18,5 г; KH₂PO₄ 5,8 - 6,2 г; Na₃C₈H₅O₇×5H₂O 0,8 - 1,2 г; MgSO₄×7H₂O 0,15 - 0,25 г; казаминокислоты 0,15 - 0,25 г; дрожжевой экстракт 0,8 - 1,2 г, рН 7,1 - 7,3, и обработанные лизоцимом. Максимальная частота трансформации клеток составляет 5×10⁵ трансформантов/мкг ДНК. Изобретение позволяет упростить способ и повысить частоту трансформации.

СПОСОБ ПЛАЗМИДНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА путем их обработки лизоцимом, отличающийся тем, что перед обработкой клетки сибиреязвенного микроба выращивают в среде, содержащей, г/1 л воды:
(NH₄)₂SO₄ 1,8 - 2,2
K₂HPO · 3H₂O 18,1 - 18,5
KH₂PO₄ 5,8 - 6,2
Na₃C₈H₅O₇ · 5H₂O 0,8 - 1,2
MgSo₄ · 7H₂O 0,15 - 0,25
Казаминокислоты 0,15 - 0,25
Дрожжевой экстракт pH 7,1 - 7,3. 0,8 - 1,2