СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ BACILLUS ANTHRACIS Российский патент 1998 года по МПК C12P19/34 C07H21/00 

Изобретение относится к биохимии и бактериологии и может быть использовано для получения нуклеиновых кислот у возбудителя сибирской язвы и других спорообразующих бацилл.

Общий принцип получения нуклеиновых кислот заключается в выращивании максимального количества биомассы, полного разрушения бактериальных клеток с последующим отделением нуклеиновых кислот от белков, полисахаридов и других клеточных элементов.

При работе с возбудителем сибирской язвы возникают трудности, связанные с высокой устойчивостью этого микроорганизма к воздействию физико-химических факторов и способностью к спорообразованию (Инструкция о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность, возбудителями инфекционных заболеваний I II групп. Саратов 1979).

Для разрушения клеток существует ряд методов: замораживание и оттаивание, деструкция осмотическим шоком или с помощью ферментов, воздействие лизирующими агентами, а также механическая обработка в гомогенизаторе, ультразвуковом дезинтеграторе. Выбор метода выделения нуклеиновых кислот обуславливается в основном клеточной структурой микроорганизма (П. Зентбуш, Молекулярная и клеточная биология. М.Мир, 1982, с.50.).

Известен метод получения нуклеиновых кислот из клеток Bac. cereusthuringiensis ( Африкян Э.К. Энтомопатогенные бактерии и их значение, изд. А.Н.Армянской ССР,1973, с.418).

Свежую культуру бактерий с агаризованного косяка пересевают на мясо-пептонный бульон и выращивают на качалке в пробирках в течение 8 ч. Затем культуру пересевают в колбу с 1л бульона и инкубируют на качалке при 37^oC. Через 10 ч в колбу добавляют в конечных концентрациях глицин 2,5% сахарозу 20% и культивирование продолжают в течение 3 ч при умеренном перемешивании, после чего вносят лизоцим из расчета 200 мкг/мл. Инкубацию при малых оборотах качалки продолжают еще в течение 2 ч. При микроскопии отмечают массовый лизис клеток. После центрифугирования и суспендирования осадка в цитратной смеси лизоцим в той же концентрации вновь добавляют в присутствии ЭДТА и ТРИС буфера при pH 8,0. После 30-ти минутного инкубирования добавляют 2%-ный раствор лаурилсульфата натрия, pH-8,0. Продолжают выращивание в течение 15 мин при 37^oC и добавляют в 4-х кратном объеме цитратно-солевой буфер (2М хлористый натрий и 0,05М цитрат натрия) и выдерживают при 4^oC 30 мин. После центрифугирования к осадку добавляют цитратно-солевой раствор, инкубируют 30 мин и после очередного центрифугирования к осадку добавляют 95% этанол. Следующий этап заключается в том, что в полученную суспензию вносят 0,9М хлористый натрий и 0,01М цитрат натрия и инкубируют при 37^oC в течение 15 мин. Затем вновь добавляют лизоцим в концентрации 200 мкг/мл в сочетании с ЭДГА и ТРИС-буфером, pH 8,0 и помещают в термостат на 30 мин при 37^oC. После обработки 2% -ным лаурилсульфатом натрия, pH 8,0 смесь выдерживают при 37^oC 15 мин и добавляют 4 объема цитратно-солевого раствора (2М хлористый натрий и 0,05М цитрат натрия). Инкубация 30 мин при 37^oC. После центрифугирования к осадку добавляют цитратно-солевой раствор и инкубируют при 30^oC. Затем суспензию центрифугируют, добавляют этанол и вновь центрифугируют. Полученный осадок обрабатывают смесью хлороформа и октанола в соотношении 5 1 и вновь центрифугируют. РНК из смеси удаляют добавлением РНК-азы в концентрации 20 мкг/мл в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем проводят депротеинизацию смесью хлороформа и октанола. После этого производят осаждение этанолом и экстракцию в цитратно-солевом растворе. Для получения очищенной ДНК проводят 4-краткую депротеинизацию смесью хлороформа и октанола.

Способ позволяет получить очищенную ДНК для дальнейшего молекулярно-генетического исследования. Недостатком его является длительность и большой набор используемых реактивов. Он не обеспечивает полного лизиса клеток Bac. antharacis и соответственно гарантированного обеззараживания культуры сибиреязвенного микроба и увеличения выхода готового продукта.

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является выбранный в качестве прототипа способ получения бактериальных нуклеиновых кислот [1]
По этому способу свежеосажденные клетки в пробирке из нержавеющей стали смешиваются с лизоцимом в концентрации 2 мг/г и растворяются в солевом ЭДГА (1 мл/г). Полученная смесь выдерживается в термостате 20 мин при 37^oC, pH доводится до 9,0 добавлением раствора едкого натра. После начала лизирования клеток их быстро замораживают в смеси сухого льда с ацетоном. При этом достигается температура -20^oC. Экспозиция 20 мин. Затем проводят оттаивание при 60^oC. После этого к суспензии добавляют ТРИС-СДС-буфер в концентрации 10 мл на 1г биомассы. Следующим этапом добавляют равный объем фенола pH 9,0 и полученную смесь встряхивают на холоду (ниже -4^oC) в течение 20 мин в колбе со стеклянной пробкой. Полученную суспензию разделяют на 2 слоя при центрифугировании на низкоскоростной центрифуге. Водную фазу отсасывают и осветляют при центрифугировании (12000 об/мин). Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением 3-х объемов холодного этанола. Нитевидный осадок выбирается накручиванием на стеклянную палочку. После сушки получается сухой порошок, содержащий нуклеиновые кислоты.

У прототипа и изобретения имеются следующие сходные существенные признаки.

Подготовка биомассы, обработка ее лизоцимом в присутствие ЭДТА в течение 20 мин при 37^oC, pH 9,0, что необходимо для разрушения клеточной оболочки.

Замораживание и оттаивание суспензии, обеспечивающие более полный лизис клеток.

Дополнительное лизирование клеток ТРИС-СДС-буфером. Обработка клеточной суспензии фенолом в соотношении 1:1 с целью очистки нуклеиновых кислот от белков, полисахаридов и других клеточных элементов.

Осаждение нуклеиновых кислот тройным объемом холодного этанола.

Недостатком прототипа является неполное обеззараживание Bac. antharacis, связанное с частичным лизисом клеток, и более низкий выход нуклеиновых кислот.

Этот недостаток обусловлен высокой устойчивостью возбудителя сибирской язвы к воздействию физико-химических факторов, способностью к спорообрааованию. Поэтому обработка клеток Bac. antharacis по методу К.Миура не позволяет добиться их полного лизиса, а значит и гарантированного обеззараживания. Используемое в этом способе количество лизоцима (2 мг на 1 г биомассы) и температура замораживания (-20^oC, даже при трехкратном повторе операции не позволяют выполнить вышеописанные требования, что снижает выход нуклеиновых кислот.

Целью изобретения является повышение выхода нуклеиновых кислот и обеспечение гарантированного обеззараживания патогенных бацилл.

Поставленная цель достигается тем, что подготовку биомассы проводили с предварительным подращиванием в течение 16-17 ч, с соблюдением условий герметизации колб. Биомассу обрабатывали лизоцимом в концентрации 20-25 мг на 1 г биомассы в присутствии ЭДТА, выдерживали в термостате при 37^oC в течение 20 мин. Затем суспензию трехкратно замораживали в жидком азоте (-196^oC) с последующим оттаиванием при 60^oC. Процесс замораживания длился 40-60 с. Проводили дополнительное лизирование ТРИС-СДС-буфером. Нуклеиновые кислоты очищали фенолом и осаждали тройным объемом холодного этанола.

По отношению к прототипу у изобретения имеются следующие отличительные признаки.

Культивирование биомассы проводили с предварительным подращиванием в течение 16-17 ч с соблюдением условия герметичности колб, что обеспечивает получение максимально возможных количеств микробных клеток в логарифмической фазе роста при минимальной споруляции.

В табл.1 приведены сравнительные данные по спорообразованию и выходу биомассы при различных способах культивирования.

Увеличение количества лизоцима с 2 мг/г до 20-25 мг/г обеспечивает более полный лизис клеток Bac. antharacis, а соответственно повышение выхода нуклеиновых кислот.

В табл. 2 приведены сравнительные данные степени лизиса клеток и выхода нуклеиновых кислот от концентрации лизоцима по аналогу, прототипу и изобретению.

Снижение температуры замораживания до -196^oC и сокращение времени с 20-30 мин до 40-60 с способствует полноте лизиса и повышению выхода нуклеиновых кислот, что показано в табл.3.

Возможность осуществления изобретения с использованием полной совокупности заявляемых признаков подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1. В опыте использовали вакцинный штамм Bac. antharacis СТИ-1. Посев споровой взвеси производили на 2 чашки Петри с агаром Хоттингера. Выращивали в термостате при 37^oC в течение 24 ч. На следующий день отбирали типичные колонии сибиреязвенного микроба и пересевали петлей в 250 мл. колбы с бульоном. Колбы закрывали ватно-марлевыми пробками и поверх них резиновыми колпачками. Последние использовали для создания повышенного содержания CO₂ в колбах, так как бикарбонат ингибирует процесс спорообразования и стимулирует чувствительность культур Bac. antharacis к лизоциму (Chatterjee B.R. Williams R. P. j. Bact. 1985. vol. 89 p.1128-1133). Колбы помещали в термостатированную качалку на 8 ч при 37^oC. Через 6 ч делали контрольные мазки. Споровые формы сибиреязвенного микроба отсутствовали. Затем производили пересев 20 мл бульонной культуры в 750 мл колбы с 200 мл бульона и помещали в термокачалку на 9 ч при 37^oC. Вновь использовали резиновые колпачки. Затем культуру центрифугировали и полученную биомассу трижды отмывали от среды забуференным физ. раствором. Вес влажной биомассы 12г. Ее переносили в пластмассовый центрифужный стаканчик и добавляли 240 мг лизоцима (20 мг/г) и 12 мл солевого ЭДГА (1 мд/г). Содержимое стаканчика тщательно перемешивали и оставляли в термостате на 20 мин при 37^oC. Затем суспензию замораживали в жидком азоте (-196^oC), а затем оттаивали в ультратермостате при 60^oC в течение 7-10 мин. Эту операцию повторяли 3 раза. После последнего оттаивания добавляли ТРИС-СДС-буфер в количестве 96 мл (6 мл/г), тщательно перемешивали и оставляли в термостате на 20 мин при 37^oC. Затем добавляли 120 мл свежоперегнанного фенола pH 9,0 и встряхивали на холоду 30 мин. Суспензию переносили в стеклянный центрифужный стаканчик и разделяли на два слоя на центрифуге при 5000 об/мин. Верхний слой отсасывали в стеклянный цилиндр. Объем жидкости составил 90 мл. Осторожно добавляли 270 мл холодного этанола (тройной объем) и перемешивали. Полученный нитевидный осадок извлекали накручиванием на стеклянную палочку и переносили в центрифужный стаканчик. Осадок 3 раза сушили спиртом, 3 раза смесью Никифорова (спирт + эфир) и 3 раза эфиром. Вес полученного сухого порошка составил 11,4 мг. Сухую смесь нуклеиновых кислот запаивали в ампулы и оставляли для дальнейшего исследования.

Выход нуклеиновых кислот составил 0,95 мг на 1 г биомассы. Контрольный высев через 30 мин после обработки лизоцимом показал отсутствие роста, т.е. полный лизис клеток.

Пример 2. Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что культивирование с предварительным подращиванием микробных клеток производили в течение 16 ч, концентрация лизоцима составила 22 мг/г биомассы и замораживание суспензии клеток проводили в течение 40 с. Выход нуклеиновых кислот также составил 0,95 мг на 1г биомассы, а контрольный высев показал отсутствие роста.

Пример 3. Выполнялся аналогично примерам 1 и 2. Отличие заключалось в том, что время культивирования составляло 16,5 ч, для лизирования использовали 22 мг лизоцима на 1 г биомассы, а замораживание суспензии проводили в течение 45 с. Выход нуклеиновых кислот составил 0,95 мг/г биомассы. Отмечено отсутствие роста при контрольном высеве.

Как показали экспериментальные испытания, уменьшение времени культивирования ниже 16 ч не обеспечивает получения максимально возможных количеств микробных клеток, а следовательно, снижает выход готового продукта. Увеличение же этого времени приводит к образованию спор и соответственно не обеспечивает гарантированного обеззараживания Bac. anthracis.

Уменьшение концентрации лизоцима менее 20 мг/г биомассы не обеспечивает полноты лизиса клеток, что снижает выход готового продукта и не гарантирует обеззараживание клеток. Увеличение количества лизоцима более 25 мг/г биомассы нецелесообразно.

Заявленные интервалы времени замораживания клеточной суспензии в жидком азоте необходимы и достаточны в совокупности с остальными признаками изобретения для достижения поставленной цели.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование позволяет осуществлять получение нуклеиновых кислот из различных спорообразующих микроорганизмов при гарантированном их обеззараживании и увеличить выход готового продукта более чем на 70% по сравнению с прототипом.

Использование: в биохимии, бактериологии, биотехнологии. Сущность изобретения: биомассу получают с предварительным подращиванием микробных клеток Bacillus anthracis в условиях герметизации колб с культурой. Биомассу обрабатывают лизоцимом в присутствие ЭДТА в концентрации 20 мг на 1 г биомассы. Полученную суспензию трехкратно замораживают в жидком азоте с последующим оттаиванием при 60^oC. Время замораживания 40-60 с. Затем проводят дополнительное лизирование ТРИС-СДС-буфером. Нуклеиновые кислоты очищают фенолом и осаждают холодным этанолом. 3 табл.

Способ получения нуклеиновых кислот Bacillus anthracis, включающий подготовку биомассы, обработку ее лизоцимом в присутствии ЭДТА в течение 20 мин при 37^oС и рН 9,0, трехкратное замораживание и оттаивание суспензии, дополнительное лизирование ТРИС-СDС-буфером, обработку фенолом в соотношении 1 1 и осаждение нуклеиновых кислот тройным объемом холодного этанола, отличающийся тем, что подготовку биомассы проводят с предварительным подращиванием микробных клеток с соблюдением условий герметизации колб с культурой в течение 16 17 ч, обработку лизоцином в концентрации 20 25 мг/г биомассы, замораживание осуществляют в жидком азоте в течение 40 60 с.