Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой бирепг ликонную векторную плазмиду, обладающую способностью стабильно поддерживаться в автономном состоянии в клетках Escherichia coli и бацилл и предназначенную для клонирования чужерож- ных фрагментов ДНК в клетках этих бактерий, и способ конструирования данной плазмиды.
Целью предлагаемого объекта изобретения является создание более удобного челночного вектора, на основе
которого может быть осуществлено клонирование чужеродных фрагментов ДНК как в клетках C.coli, для которой приемы генетического манипулирования
наиболее отработаны, так и в бактериях большинства видов p. Bacillus.
Удобство в работе с этим вектором связано с небольшим размером его (4,8 т.п.о.), доступностью для клонирования 10 участков узнавания различных эндонуклеаэ, включая одновременное наличие Eco RI и Hind III - сай-гч , тов, наличием маркеров резистентнос- ти к тетрациалину и возможностью использовать в качестве хозяев Е.со- li, B.thuringiensis, E.cereus. В,sub- tills и B.megaterium.
Пример 1. ДИК плазмид р11С19 и рВС16 выделяют следующим образом,. Культуры клеток E.coli VM 83, содержащих рИС19 и В.subtil is, несущих рВС16, выращивают в 15 мл среды LB (триптон 10 г, дрожжевой экстракт
5 г, NaCl 8 г, вода 1 л). до конца
логарифмической фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием (ЬООО g, 5 мин, 2°С), ресуспендируют в 0,5 мл лизирующего раствора (лизоцим 2мг/мл ЭДТА - Na 10 мМ, глюкоза 50 мМ, трис-HCl 25 мМ, рН 8,0). Через 5 мин инкубации суспензии на ледяной бане при температуре 0-2°С прибавляют 1 мл раствора, содержащего 1% доде- цилсульфата натрия (SDS) и 0,2 ц. NaOH, и лизат осторожно перемешивают Затем вносят 0,75 мл ЗМ NaCH COOH, лизат перемешивают и выдерживают 1 ч при 0-2°С. Клеточные остатки удаляют центрифугированием (10000 g, 15 мин, 2°С). К супернатанту добав- ляют 2,5 объема охлажденного до -20°С этилового спирта и через 2 ч инкубации при -20°С выпавший осадок ДНК собирают центрифугированием Ј5000, 5 мин), ДНК растворяют в
0,9 мл воды, прибавляют 0,1 мл ЗМ NaCH,COOH, рН 7,0 и снова осаждают этиловым спиртом, Эту операцию повторяют еще раз, осадок ДНК слегка подсушивают потоком воздуха и раство ряют в 0,2 мл 10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5.
2 мкг ДНК плазмнды рВС16 расщепляют рестрйктазой Eco RI (3 ед,) в 40 мкл буфера следующего состава: 100 мМ трис-HCl, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCllt 1 мМ дитиотрептол (ДТТ), рН 7,5. ДНК плазмиды рИС19 (пять образ,
0
5
0
35 40 4$
50
55
цов - по 2 мкг) гидролизуют эндонук- леазой Ира II (1 ед; 0,2 ед, 0,04 ед, 0,008 ед. и 0,00016 ед, на образец) в 40 мкл 10 нГ трис-HCl, 10 мМ MgC. , 1 мМ ДТТ, рН /,. Реакнци ведут 1 ч при 37 С и останавливают прогреванием инкубационной смеси при 65-70°С в течение 10 мин. Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза.
Для достраивания (заступления) липких концов Eco RI - фрагментов ДНК рВС16 и Нра II - фрагментов ДНК рИС19 фрагменты (пл 2 мкг) смешивают и обрабатывают в 40 мкл инкубационной смеси, содержащей 50 мМ трис-HCl, рН 7,2, 10 мМ MgSOf, 1мМ ДТТ,50 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 4 нмоль каждого dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP и 2 ед. фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I, Реакцию ведут в течение 1 ч при комнатной температуре и останавливают добавлением 2 мкл 0,5 М ЭДТА, Затем проводят дегфотеи- низацию смесью фенол - хлороформ и осаждают ДИК 2,5 объемами спирта (-20°С, 12 ч).
Eco RI - фрагменты ДНК рВС16 (1,5 мкг) и фрагменты ДНК рИС19 (1,5 мкг), полученные в результате ее частичного гидролиза Нра (средняя величина фрагментов 1-2 т.п.н,), соединяют с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в среде, содержащей 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 25 мМ NaCl, 10 мМ MgCl, 10 мМ ДТТ, 0,5 мМ АТР, 20-40 мкг/мл ДНК, 1-2 ед/мл ДНК-лигазы фага Т4. Смесь выдерживают при температуре -4 С в течение 4-16 ч, затем снижают концентрацию ДНК в 5-10 раз и продолжают инкубацию в течение 12-24 ч. Эффективность соединения фрагментов ДНК контролируют электрофоретическим анализом,°
Лигированной ДНК трансформируют обработанные CaCl i клетки E.coli JM 83 или клетки аналогичного штамма, имеющего такие генетические характеристики, как и (lac pro), F tra D36, pro AB, lac Ia, Z M15. Са -клетки E.coli получают следующим образом: 0,1 мл ночной культуры вносят в 10 мл среды LB и выращивают при температуре 37°С со встряхиванием на качалке до титра 3 10 кл/мл. После охлаждения культуры на ледяной бане (0°С, 10 мин) клетки центрифугируют (5000 g, 10 мий, 0°С), суспендируют в 10 мл
0,1 М СаС) г и шшк рз нвают 1 ч. Клетки повторно центрифугируют (5000 g, 10 мин, 0°Г.) , затем ресуспеидируют в 0,5 мл 0,1 М CaCli, 0°С. На следующий день 0,1 мл Ca f-клеток смешивают с 0,05 мл ДНК (10 мкг/мл), инкубируют 1 ч при температуре 0-2СС и 5 мин при температуре 42°С и затем переносят в пробирку с 1,5 чл среды LB. После 2 ч инкубации в этой среде при 37 С со встряхиванием клетки высевают на чашки с индикаторными (Lac) средами, содержащими тетрациклин (15 мкг/мл). В качестве индикаторных сред используют среду Мак-Конки или среду с Xgal (5-бром-4-хлор-3 индо- лил- -галактозид). Ьас -клетки формируют на этих средах, темно-красные и синие колонии соответственно. Колонии, имеющие такую окраску, перекалывают последовательно на агарнзованну среду LB, содержащую тетрациклин (15 мкг/мл) и ампициллин (100 мкл/мл и агаризованную среду LB с тетрациклином (15 мкг/кл). Чашки инкубируют в течение 18 ч при 37 С.
Из клеток клонов с фенотипом TcrLac+Ap5 выделяют плазмидную ДНК. Выделенную ДНК и ДНК плазмид рИС19 и рВС16 обрабатывают рестриктазами Eco RI и Нра П и анализируют с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. В качестве маркеров размера ДНК используют Eco RI, Hind III и Eco RI+Hind III- фрагменты ДНК фага и Eco RI - фрагменты ДНК плазмиды pBR 322. После отбора клонов с плазмидами, имеющими минимальный размер (около 4,8т.п.н.) проводят также анализ структуры этих.плазмид с помощью других рест- риктаз, в частности рестриктаз, сайт которых вх одят в полилинкерную последовательность рИС19.
П р и м е р 2. Проверку возможности репликации плазмиды pOL YA 15 в клетках бацилл проводят следующим образом.
Получают компонентные клетки B.subtilis и трансформируют их ДНК плазмиды pOL YA 15. Отбор трансформантов проводят на чашках с агари- зованной средой LB, содержащей тетрациклин (15 мкг/мл). Частота трансформации составляет .
Получают протопласты B.megaterium КМ и трансформируют их ДНК плазмиды pOL YA 15. Для этого используют SMMP15
0
буфер. Этот же буфер используют и при последующей отмылке протопластов и приготовления разведений протопластов, Для трансформации берут в работу 0,5 мл суспензии полученных протопластов, смешивают с ДНК, растворенной в SMMP буфере,и добавляют 1,5 мл полиэтиленгликоля (ПЭГ). После раз- 10 бавления в 5 мл SMMP буфера клетки центрифугируют и ресуспендируют в 1 мл SMMP буфера. Через 1,5 ч суспензию высевают на чашки Петри со средой ДМЗ. Чашки инкубируют при температуре 37 С в течение 2 сут. Колонии, образованные регенерировавшими протопластами, перекалывают на LB-arap, дополненный тетрациклином (15 мкг/мл). Частота трансформации составляет около, 20%.
Получают протопласты В. thuringien- sis var, gelleria 69/6 и трансформируют их ДНК плазмиды pOL YA 15 следующим образом: ночную культуру разво- 25 Дят в 20 раз в среде 0,15 (на 10 л НгО трис-основание 150 г,КС1 430 .мг, NH4C1 12,5 г, NaCl 725 мг, Na7S04к t10H40 3,75 г, Fed 4Н70 6,25 мг, сахароза 513-5 г, после автоклавиро- вания добавляют 100 мл 10%-ного дрожжевого экстракта, 100 мл 0,1 М мл 2М MgCU и 50 мл 40%- ной глюкозы). Подращивают культуру при температуре 32°С до оптической плотности 0,7 ед (550 нм). Клетки центрифугируют (3000 g, 15 мин) и ресуспендируют в 1/10 первоначального объема среды 0,15, содержащей 5 мг/мп лизоцима, Культуру инкубируют в течение 60 мин при температуре 37°С, затем протопласты собирают центрифугированием (3000 g, 20 мин) и ресуспендируют в 1/50 первоначального объема среды 0,15. К 0,1 мл плазмид- ной ДНК, растворенной в среде 0,15, добавляют 0,5 мл суспензии протопластов, а затем сразу же 1,5 мл 40%-ного раствора ПЭГ. После тщательного перемешивания смесь разбавляют в 5 мл среды 0,15. Протопласты ® собирают центрифугированием и ресуспендируют в 2 мл среды 0,15. Образцы переносят на поверхность 1%-ной ага- ризованной срецы 0,15 и инкубируют 2-3 ч при температуре 32°С. Для реге- 5 нерации протопласты переносят в
0,4%-ную агаризованную среду 0,15 и высевают на поверхность той же среды, содержащей 1% агара и тетоациклин
0
0
5
10
15
(20 мкг/мл). Частота трансформации КГ-1СГ7.
Из клеток B.thuringieneia var. galleria 69/6 (pOLYAIS) в клетки В,thuringiensis var. Kurstaki strr плазмиду pOLYA15 передают путем трансцепции при совместном культивировании донорского и реципиентного штамма. Для этого исходный жидкие культуры по 0,2 мл засевают на чашки ОДА и культивируют в течение 18 ч при температуре 37°С. Ресуспендируют полученную совместную культуру в 1 мл среды до конечного титра 10 кл/ /мл. Высевают полученную суспензию до 0,2 мл на чашки с МПА, содержащие 100 мкг/мл стрептомицина и 20 мкг/мл тетрациклина. Аналогичным образом поступают при передаче плазмиды pOLYA15 из В.thuringiensis var, Kurstaki МГЯ B.cercus 968 RifR.
Частота переноса около ,
Для определения автономного состояния плазмиды pOL YA15 в бациллах из клеток трансформантов и трансципи- ентов выделяют плазмидную ДНК и проводят ее электрофоретический анализ, В качестве контроля используют ДНК плазмиды pOL YA15.
Стабильность поддержания плазмиды pOLYA15 в клетках бацилл определяют по величине процентного содержания тетрациклинрезистентных клонов трансформантов и трансципиентов после их выращивания в неселективных условиях. 35 Полученные штаммы не утрачивают плаз- ,миду pOL YA15 в течение 60 генераций,
Прим ер 3, Для конструирования гибридных плазмид на основе pOL YA15 ДНК этой плазмиды гидроли- 40 зуют одной из рестриктаз, сайты которых находятся в полилинкерной последовательности, и объединяют путем легирования с фрагментами чужеродной ДНК, Лигированной ДНК трансформируют Са -клетки E.coli VM 83 или аналогичного штамма, как описано в примее 1, Отбор трансформантов с рекомби20
25
30
45
5
0
0
5
0
5
нантными плазмидами ведут по Tc Lacf- фенотипу.
Формула изобретения
1.Векторная пчатмилная ДНК pOLYA15, предназначенная для клонирования чужеродных генов в клетках Escherichia coli и Bacillus spp,, размером 4,8 т,п.о,, содержащая
участок плазмиды рИС19 - 1,7 т.п.о., фланкированный Нра 11-фрагментамч размером 404 и 34 п.о,, с последовательностью ori V, необходимой, для репликации плазмиды, геном lacZ и полилинкерной последовательностью, включающей сайты для 10 рестриктаз, пригодные для встраивания фрагментов чужеродной ДНК;
Есо RI-фрагмент плазмиды рВС1б, несущий ori V этой плаэмиды и ген резистентности к тетрациклину, размером 3,1 т,п.о., емкостью до 10 т.п.о.
уникальные сайты рестрикции:EcoRI, Sad, Kpnl, Sma I, BamHI, Xbal, Sal I, Pst I, Sph I и Hind III;
генетические маркеры: ген устойчивости к тетрациклину-Тсг, ген устойчивости у ампициллину-Ampг, ген- LacZ, емкостью до 10 т.п.п.
2.Способ конструирования векторной плазмидной ДНК pOLYA15, заключающийся в том, что ДНК плазмиды рВС16 расщепляют эндонуклеазой EcoRI, ДНК плазмиды рИС19 подвергают частичному гидролизу эндонуклеазой Нра II, липкие концы Есо RI и Нра 11-фрагментов затупляют с помощью фрагмента Кпенова ДНК-полимеразы I и сшивают в результате обработки ДНК-лигазой, затем смесью молекул трансформируют шГамм E.coli VM 83, проводят селекцию клонов с бирепликонными плазмидами по фенотипу из трансформантов с таким фенотипом, выделяют плазмиды, осуществляют их рестрикционный анализ
и отбирают плазмиду с минимальным размером 4,8 т,п,о.
Изобретение относится к генетической инженерии и связано с целью получения нового биреготиконного вектора. Сконструирована бирепликонная плазмида, предназначенная для клонирования фрагментов чужеродной ДНК в клетках Escherichia coli и 5 различных видов Bacillus spp. Для этого плазмиду рИС 19 подвергают частичному гидролизу эндокуклеазой Нра11, плазмиду рВС 16 расщепляют эндонуклеазой EcoR I, липкие концы фрагментов достраивают до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1, затем лигируют друг с другом, смесью молекул трансформируют штамм Е. coli, VM 83 и отбирают клоны с фенотипом Тс , Amp 1, LacZ, содержащие бирепликонную плазмиду, Из трансформантов выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикцион- нын анализ и отбирают плазмиды минимального размера. Одна из отобранных плазмид имеет мол. м. 4,2 Ttn.o., которую обозначают pOLYA 15. Она состоит из участка плазмиды рИС t9 размером 1,7 т.п.о., ограниченного Нра Ц-фрагментами размером 404 и 34 nto, и содержащего последовательность ori V, ген lac Z 7 с полилинкерной последовательностью, включающей сайты для 10 рестриктаз (EcoRI, Sad, Kpnl, Sma.I, Bam H.I, Xba I, Sal I, PstI, SphI, Hinl III). Вторым компонентом гибридной плазмиды является EcoR I-фрагмент плазмиды рВС 16, несущий ori V этой плазмиды и ген ре- зистентности к тетрациклину Тс раз- мером 3,1 т.п.о. Полученная гибридная плазмида стабильно наследуется как в клетках Eecherichia coli, так и в клетках Bacillus spp. 2 с.п. ф-лы. I (Л с й о оо со оэ
| lullivan M.A., Jasbin R.S., Joung F.E | |||
| Now shuttle vectors for Bacillus subtilis and Escherichia coli with allow rapid detertion of inserted fragment | |||
| Cene, 29(1984) | |||
| p.p.,21-26. |
