Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть применено для индикации бактерий Pasteurella multocida при диагностике заболевания у птиц и подготовке контрольно-производственных штаммов в работе.
Известно, что посредством световой микроскопии в препаратах, приготовленных из патологического материала, опознают пастереллы обычно в виде биполярно окрашенных палочек. Однако биполярное окрашивание их как ценное диагностическое свойство выражено не всегда и остается невыясненным. Известно, что в тканях и крови животных и птиц возбудитель пастереллеза представляет собой маленькую, короткую, овоидную бактерию, а в культурах он полиморфный: коккообразные формы (моно- и диплококки) присутствуют чаще, овоидные и гигантские палочковидные формы (обычно при просмотре слабо- и авирулентных штаммов) - изредка, причем содержатся фильтрующиеся формы, "доклеточные" формы. Следовательно, пастереллы сами по себе морфолабильны. Ввиду того, что динамика и условия морфологической изменчивости микробной клетки этих бактерий не изучены, индикация их является еще несовершенной.
За прототип взят общепринятый способ индикации пастерелл в патологическом материале от павших и клинически больных птиц посредством световой микроскопии мазков-отпечатков, окрашенных по Романовскому-Гимза.
Недостатком этого способа является неточное определение морфологических признаков у пастерелл по причине спонтанного отбора патологического материала для приготовления препаратов.
Задачей изобретения является повышение точности индикации бактерий Pasteurella multocida при пастереллезном процессе у птиц путем уточнения их морфологии при размножении в организме и трупах птиц, определяя биполярную структуру как псевдопалочку, состоящую из двух коккоподобных клеток.
Поставленная задача достигается тем, что пастереллы (при биполярной структуре) наносят на слизистую оболочку небной щели птиц и через 10-15 мин в слизи с места аппликации, затем при септицемии (особенно в период терминальных состояний организма) в плазме крови и на эритроцитах обнаруживают под микроскопом бактерии в виде малой коккоподобной, с момента агонии и на протяжении первого посмертного часа - в кокко- и диплококкоподобной, на протяжении 1-3 посмертного часа - в виде обычной биполярной, а в последующем - в виде малой и большой коккоподобной и биполярной морфологических структурах. Биполярную структуру пастерелл легко установить как результат парного расположения коккоподобных бактерий, если внести патологический материал (например: кровь из сердца от павших птиц) в жидкие питательные среды, в физраствор или в обычную воду и сразу, слегка встряхнув содержимое, приготовить из надосадочной жидкости препараты для микроскопии.
Существенным отличием является то, что при пастереллезном процессе у птиц отбирают патологический материал для микроскопических исследований целенаправленно и обнаруживают (под микроскопом) в инфицированном организме возбудитель болезни в виде коккоподобной бактерии, а в трупе птицы - в виде одиночных коккоподобных бактерий и в форме биполярной структуры, наиболее и равномерно выраженной на протяжении 1-3 посмертного часа и являющейся особенностью парного расположения таких же бактерий, становящихся с разpушением взаимосвязи коккоподобными.
В исследованиях применяли контроль-производственный штамм бактерий Pasteurella multocida N 55, соответствующий полевым штаммам пастерелл по серовару A: I на 89% .
П р и м е р 1. При выраженной биполярной структуре пастерелл в трупе птицы через 3 посмертных часа брали патологический материал (кровь из сердца) и наносили на слизистую оболочку небной щели интактных цыплят и голубей. Через 5, 10 и 15 мин брали бактериологической петлей слизь с места аппликации бактерий у птиц и переносили в каплю физраствора на предметном стекле, готовили мазки, их после подсыхания фиксировали и окрашивали по Граму и Романовскому-Гимза. Посредством световой микроскопии приготовленных препаратов обнаруживали в слизи с небной щели птиц (в основном через 10-15 мин с момента заражения) грамотрицательные, не окрашивающиеся биполярно мелкие коккоподобные бактерии. Всего поставлено 20 биопроб и результаты микроскопических исследований были аналогичными. Вместе с тем этот же материал вносили в жидкие питательные среды (МПБ и бульон Хоттингера) в физраствор, в обычную воду и после легкого одномоментного встряхивания содержимого в пробирках приготавливали из надосадочной жидкости препараты при тех же методах окраски. Аналогично и в этих случаях обнаруживали грамотрицательные, не окрашивающиеся биполярно коккоподобные бактерии. Свободное разрушение биполярной структуры микроорганизма на две коккоподобные бактерии свидетельствует о том, что пастереллы - это не биполярные палочки, а коккоподобные бактерии.
П р и м е р 2. При выраженной биполярной структуре пастерелл в трупе птицы через 3 посмертных часа брали патологический материал (кровь из сердца) и наносили на слизистую оболочку небной щели интактных цыплят и голубей. При развитии септицемии, в частности в период терминальных состояний организма птиц, брали из крыльцовой вены пробы крови и готовили на предметных стеклах мазки. От павших птиц брали кровь из сердца на протяжении 3 посмертных часов через каждые 15 мин, далее через каждый час до 10 посмертных часов и также готовили на предметных стеклах мазки. Мазки фиксировали и окрашивали по Граму и Романовскому-Гимза. Посредством световой микроскопии приготовленных препаратов обнаруживали при септицемии (особенно в период терминальных состояний организма птиц) в плазме крови и на эритроцитах возбудитель пастереллеза в виде малой коккоподобной, с момента агонии и на протяжении первого посмертного часа - в кокко- и диплококкоподобной, на протяжении 1-3 посмертного часа - в виде обычной биполярной, а в последующем - в виде малой и большой коккоподобной и биполярной морфологических структур. Всего поставлено 10 биопроб и в проведенных при них микроскопических исследованиях получены аналогичные результаты. Следовательно, биполярная структура пастерелл формируется с момента агонии, начиная с диплококкоподобного формирования лишь у малой части бактерий, тогда как с момента летальности птиц проявляется на протяжении 1-3 посмертного часа формирование выраженной биполярности у значительного числа бактерий. Исходя из этого, возбудитель пастереллеза паразитирует в коккоподобной, а переживает в трупах птиц и различном другом инфицированном материале в коккоподобной форме и биполярной структуре бактерий.
П р и м е р 3. При выраженной биполярной структуре пастерелл в трупе голубя через 3 посмертных часа брали патологический материал (кровь из сердца) и наносили на слизистую оболочку небной щели интактных цыплят-бройлеров массой тела 1,0-1,2 кг. Птиц вскрывали в момент агонии, из сердца брали кровь и стабилизировали ее гепарином (конечная концентрация его 0,5% ). Через каждые 10 мин на протяжении первого посмертного часа, а затем через 2 и 3 посмертных часа пробы собранной крови центрифугировали при 3 тыс. об/мин 3 мин, из плазмы крови готовили на предметных стеклах мазки, а эритроциты отмывали путем центрифугирования на фосфатно-буферном физрастворе (рН 7,0) при соотношении 1: 5 и из их взвеси при таком же соотношении готовили на предметных стеклах мазки. Мазки фиксировали и окрашивали по Граму и Романовскому-Гимза. Посредством световой микроскопии приготовленных препаратов обнаруживали на протяжении 30 посмертных минут в пробах стабилизированной крови, в частности - в плазме, мелкие кокковидные бактерии; через 30-40 посмертных минут устанавливали выраженный лизис эритроцитов при отмывании их на физрастворе. При микроскопии ядра лизированных эритроцитов были округлыми и окрашенными в светло-розовый цвет, тогда как у нелизированных (целых по форме) и у эритроцитов от интактных птиц (контрольные) ядра были обычной формы и окрашивались в синий цвет, цитоплазма - в розовый. При этом в препаратах из проб материала (особенно через 1 посмертный час, когда отмечался полный лизис эритроцитов на физрастворе), приготовленных из надосадочной жидкости, обнаруживали при микроскопии мелкие коккоподобные бактерии в большом количестве (под микроскопом при незначительном вращении микровинта). В препаратах, приготовленных из проб крови через 2 и 3 посмертных часа, обнаруживали пастереллы в форме выраженной биполярной структуры, тогда как в препаратах, приготовленных из надосадочной жидкости в пробах лизированных эритроцитов, устанавливали коккоподобные бактерии, расположенные чаще одиночно и изредка - диплококкоподобно. Микроскопические исследования проведены при 10 биопробах и результаты получены аналогичные. Следовательно, свободный лизис эритроцитов, выраженный через 30-60 посмертных минут при внесении инфицированной крови на физраствор, вызываемый мелкими кокковидными пастереллами, а также свободное разрушение биполярной структуры пастерелл на две коккоподобной формы бактерии свидетельствуют о том, что возбудитель пастереллеза птиц - это не биполярная палочка, а кокковидная бактерия.
П р и м е р 4. При равной выраженности биполярной структуры пастерелл в трупе голубя через 3 и неравной - через 8 посмертных часов брали патологический материал (кровь из сердца) и наносили на слизистую оболочку небной щели интактных голубей. Через 10-15 мин после аппликации пастерелл брали бактериологической петлей слизь с небной щели птиц и готовили на предметных стеклах мазки. В последующем при септицемии, в частности в период терминальных состояний организма птиц, брали из крыльцовой вены, а в момент летальности - из сердца пробы крови и приготавливали на предметных стеклах мазки. Мазки фиксировали и окрашивали по Граму и Романовскому-Гимза. Микроскопические исследования провели при 6 биопробах на голубях (по 3 птицы на каждую из двух проб изучаемого патологического материала). Результаты биопроб по заражающим пробам патологического материала от одного и того же трупа и соответственно проведенных при них микроскопических исследований получены неодинаковые. Так, посредством световой микроскопии препаратов, приготовленных из слизи с небной щели птиц, зараженных пробой патологического материала с периодом 8 посмертных часов, обнаруживали большие, средние и мелкие коккоподобные формы пастереллы, тогда как в мазках из слизи от птиц, зараженных пробой патологического материала с периодом 3 посмертных часа, устанавливали только мелкие коккоподобной формы бактерии. В первом случае поставленных биопроб (заражающим материалом с периодом 8 посмертных часов) обнаруживали на уровне микроскопических исследований в период септицемии, в частности при терминальных состояниях организма птиц, коккоподобной формы бактерии: большой и средней величины - чаще, малой - изредка; в период агонии - кокко- и диплококкоподобной формы бактерии; в трупе на протяжении 1-3 посмертного часа - бактерии в виде малой и большой коккоподобной формы и биполярной структуры. При другом случае постановки биопроб (заражающим материалом с периодом 3 посмертных часа) обнаруживали посредством микроскопических исследований при септицемии-мелкие коккоподобные, в период агонии и на протяжении первого посмертного часа - мелкие и средней величины коккоподобные, сравнительно изредка и диплококкоподобные, а на протяжении 1-3 посмертного часа - биполярной структуры пастереллы. В связи с этим в первом случае постановки биопроб голуби погибали через 24-36, а во втором - через 12-14 ч с момента заражения. При этом течение инфекционного процесса у птиц наглядно отличалось по остроте.
Следовательно, от пастерелл малой коккоподобной формы и при равномерной выраженности биполярной структуры этих бактерий, что очевидно проявляется в трупах птиц на протяжении 1-3 посмертного часа, зависит при естественном пути заражения птиц динамика развития морфологических признаков микроорганизма в организме и после летальности - в их трупах, а также зависит степень патогенности возбудителя болезни (или же вирулентность изолята пастерелл при освежении контрольно-производственного штамма бактерий через организм птиц). (56) Лабораторные исследования в ветеринарии. М. : Колос, 1971, с. 164.
Использование: ветеринарная микробиология. Сущность изобретения: пастереллы (при биполярной структуре) наносят на слизистую оболочку небной щели птиц и через 10 - 15 мин в слизи с места аппликации, затем при септицемии (особенно в период терминальных состояний организма) в плазме крови и на эритроцитах обнаруживают под микроскопом бактерии в виде малой коккоподобной, с момента агонии и на протяжении первого посмертного часа - в кокко- и диплококкоподобной, на протяжении 1 - 3 посмертного часа - в виде обычной биполярной, а в последующем - в виде малой и большой коккоподобной и биполярной морфологических структурах.
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ PASTEURELLA MULTOCIDA, включающий приготовление препаратов из патологического материала, их окрашивание и микроскопию с последующей идентификацией, отличающийся тем, что биполярные бактерии пастерелл из патологического материала наносят на слизистую оболочку небной щели птиц, затем готовят препараты через 10 - 15 мин после заражения из слизи с места аппликации, а также из плазмы крови и эритроцитов при септицемии, в момент агонии и на протяжении 1 - 4 посмертного часа и выявляют пастереллы в препаратах, если через 10 - 15 мин после заражения бактерии находятся в коккоподобной форме, в момент агонии и на протяжении первого посмертного часа - в кокко- и диплококкоподобной формах, через три посмертных часа - в виде биполярной псевдопалочки, а через четыре и более посмертных часа - в виде псевдопалочки с признаками полиморфизма.
